猪圆环病毒2型LN株初步分离与全基因组测序

畜牧与饲料科学　Ａ　ｎｉｍａｌ　Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ　ａｎｄ　Ｆｅｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　猪圆环病毒２型ＬＮ株初步分离与全基因组测序　梅娜丽　，刚　，李天丽　，王亚丹　（１．河南省济源市动物卫生监督所，河南济源４５９０００；２．广州齐志生物工程设备有限公司，广东广州　５１３６６３）　摘要：为了解猪圆环病毒２型（ＰＣＶ一２）在河南地区猪场的流行情况，采用常规方法对采集自河南省洛　阳市某猪场病料中的ＰＣＶ一２进行了分离，并对其全基因组进行了扩增、克隆和测序。结果表明。从患病　仔猪的病料中分离到了１株ＰＣＶ一２，命名为ＬＮ株．该毒株的全基因组序列大小为１　７６７　ｂｐ。该试验结　果为从分子水平上揭示ＰＣＶ一２的致病特性．开发ＰＣＶ一２的相关疫苗和诊断产品奠定了基础。　关键词：ＰＣＶ一２；分离；全基因组；序列测定　中图分类号：￥８５８．２８５－３：￥８５２．６５９．２　文献标识码：Ａ　文章顺序编号：１６７２—５１９０（２０１５）０１—０００４—０３　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｏｒｃｉｎｅ　Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ　Ｔｙｐｅ　２　ＬＮ　Ｓｔｒａｉｎ　ＭＥＩ　Ｎａ—ｌｉ　，ＷＡＮＧ　Ｇａｎｇ—ｇａｎｇ　，ＬＩ　Ｔｉａｎ—ｌｉ　，ＷＡＮＧ　Ｙａ—ｄａｎ０　（１．Ａｎｉｍａｌ　Ｓ　Ｓａｎｉｔａｔｉｏｎ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｊｉｙｕａｎ　Ｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｈｅｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｊｉｙｕａｎ　４５９０００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｑｉｚｈｉ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ＥｑｕｉｐｍｅｎｔＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１３６６３，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ　ｏｆ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　２（ＰＣＶ－２）ｉｎ　ｐｉｇ　ｆａｒｍｓ　ｉｎ　Ｈｅｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，ｔｈｅ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｆ　ａ　ｐｉｇ　ｆａｒｍ　ｉｎ　Ｌｕｏｙａｎｇ　Ｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｈｅｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＣＶ一２．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ．　山ｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｓｏｌａｔｅ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｉｆｅｄ．ｃｌｏｎｅｄ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ａ　ＰＣＶ一２　ｓｔｒａｉｎ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｗａｓ　ｎａｍｅｄ　ａｓ　ＬＮ．Ｔｈｅ　ｓｉｚｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｏｆ　ＬＮ　ｓｔｒａｉｎ　ｗａｓ　１　７６７　ｂｐ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｗｉｌｌ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｒｅｖｅａｌｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ　ｏｆ　ＰＣＶ－２　ａｔ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｌｅｖｅｌ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｔｈｅ　ｖａｃｃｉｎｅ　ａｎｄ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｒ　ＰＣＶ一２．ｆ　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＰＣＶ一２；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｇｅｎｏｍｅ；ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　猪圆环病毒２型（ＰＣＶ一２）是无囊膜的单股负　链ＤＮＡ病毒，属圆环病毒科圆环病毒属成员，是目　前已知的动物病毒中最小的一种。ＰＣＶ一２不仅被认　Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司；胰蛋白酶购自德国Ｍｅｒｃｋ公司；Ｄ一氨　基葡萄糖购白Ｓｉｇｍａ公司，　羟甲基氨基甲烷　（Ｔｒｉｓ）、乙二胺四乙酸二钠（ＥＤＴＡ）、十二烷基硫酸　为是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（ＰＭＷＳ）的主　钠（ＳＤＳ）、酚、酚一氯仿一异戊醇混合溶液（２５：２４：１）　购自生工生物工程（上海）有限公司；ｐＧＥＭ—Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。　１．３　溶液及培养基　氨苄青霉素（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ，　Ａｍｐ）贮存液，ＩＦＦＧ，Ｘ—Ｇａｌ，ＬＢ肉汤，ＬＢ琼脂培养　要病原体，而且还与猪皮炎与肾病综合征（ＰＤＮＳ）、　猪呼吸道疾病综合征（ＰＲＤＣ）、仔猪先天性震颤　（ＣＴ）、母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎（ＰＮＰ）　等疾病密切相关。该研究对分离自河南省洛阳市某猪　场的１株ＰＣＶ一２毒株进行了全基因组扩增、克隆和　测序，为从分子水平上揭示ＰＣＶ－２的致病特性，开发　ＰＣＶ一２的相关疫苗和诊断产品奠定基础。　１材料和方法　基，细胞培养液：含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ一１６４０培　养液，细胞维持液：含２％胎牛血清的ＲＰＭＩ一１６４０　培养液，同时含３００　ｍｍｏＬ的Ｄ一氨基葡萄糖。　１．４方法　１．１　病料　河南省洛阳市某猪场送检的疑似　ＰＭＷＳ患病仔猪病料。包括病死仔猪的淋巴结、脾　１．４．１　引物的设计与合成：根据已发表的ＰＣＶ一２　核苷酸全序列．利用Ｐｒｉｍｅｒ　５．０软件设计以下２对　弓ｌ物，Ｐ１：５　一ＣＡＣＣＴＴＣＧＧＡＴＡＴＡＣＴＡＴＣＡＡ一３　，Ｐ２：　脏等。　１．２试剂、载体、菌种ｒＴａｑ　ＤＮＡ聚合酶，性　内切酶Ｓａｃ　１／、Ｓａ／Ｉ，ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ　２　０００、入一Ｅｃｏ　ｒｌ　５　一　ｎ　ＣＡＴＧＧｒｒｎ　ＣＡＣＧＧＡＴＡＴｒＧ　Ｉ１Ａ一３　；Ａ１：５　一　ＧＡ　５　一ＧＡＣ　ＧＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＴＩ　ＴＧＡＡＡＣＴ一３　，Ａ２：　ＡＡＡＴｒＴＣＴＧＡＣＡ　ＡＡＣＧＴｒＡＣＡ一　１４　Ｉ　ｄｉｇｅｓｔ、感受态细胞ＤＨ５ｃ￣购自大连宝生物ｊ．　程有限公司：ＤＮＡ凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂　３　。引物Ｐ　、Ｐ２用于病料中ＰＣＶ一２的ＰＣＲ初筛，其　扩增片段长度为５０１　ｂｐ，引物Ａ　、Ａ：用于ＰＣＶ一２毒　株的全基因组ＰＣＲ扩增，其５　端均引入了ＳａｃⅡ酶　切位点（划线部分），扩增片段长度约为１　７００　ｂｐ　（含ＰＣＶ一２全基因）。引物由生工生物工程（上海）　盒购自北京博大泰克生物公司；琼脂糖购自　Ｐｒｏｍｅｇａ公司；蛋白酶Ｋ购自华美生物工程公司；　ＲＰＭＩ一１６４０培养液购自Ｇｉｂｃｏ公司；胎牛血清购自　收稿日期：２０１５—０１—０８　作者简介：梅娜丽（１９８５一），女，助理兽医师，主要从事动物　及动物产品检疫工作。　有限公司合成。　１．４．２组织病料总ＤＮＡ的提取：将采集自患病仔　第ｌ期　梅娜　等：猪网环病毒２型ＬＮ株初步分离Ｌｊ全基因组测序　ｌ　Ｍ　５　猪的淋巴结、脾脏等组织混合、剪碎后研磨成匀浆，　加入ＰＢＳ（含ｌ　０００　ＩＵ的青链霉素），制成２０％一　５０％（Ｗ／Ｖ）的悬液，反复冻融３次，一２０　ｑＣ保存备　用。取经过处理的病料，于室温融化后，８　０００　ｒ／ｍｉｎ　离心１０　ｍｉｎ。取２００　Ｌ上清液，加入等体积的样品　裂解缓冲液『０．０２　ｍｏｌ／Ｉ　Ｔｒｉｓ　ＨＣ１（ｐＨ＝７．５）．０．０３　２０００ｂｐ　１０００ｂｐ　７５０ｂｐ　５０１　ｂｐ　５００ｂｐ　２５０　ｂｐ　ｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ，１％ＳＤＳ］，混匀后加入４—５　Ｌ蛋白酶Ｋ　（终浓度为２００ｔｘｇ－／ｍＬ），５５　ｏＣ水浴１～３ｈ。然后加入等　体积的Ｔｒｉｓ平衡酚．混匀后１２０００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ，．　１００　ｂｐ　取上清液，依次用酚一氯仿一异戊醇（２５：２４：１）、氯　仿一异戊醇（２４：１）和氯仿抽提病料总ＤＮＡ后，用１．５　倍体积的异阿醇沉淀，一２０　ｃＩ＝放置ｌ　ｈ后．１２０００　ｒ／ｍｉｎ　离心５　ｍｉｎ。用５００　ＩｘＬ７０％乙醇洗涤２次，风干，加入　Ｍ：ＤＩ　２０００　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ：ｌ：以病料总ＤＮＡ为模板的　ＰＣＲ产物　图ｌ　患病仔猪病料中的ＰＣＶ一２ＰＣＲ产物电泳结果　ｌ　２　Ｍ　２０　Ｉ　灭菌　一蒸水溶解ＤＮＡ，于一２０℃保存备用。　１．４．３病料中ＰＣＶ一２的ＰＣＲ检测：采用２５　Ｌ反　应体系，即：上游引物（Ｐ。）０．５　Ｌ，下游引物（Ｐ２）０．５　Ｉ　，模板ＤＮＡ　３　ＩｘＬ，ｒＴａｑＤＮＡ聚合酶１２　Ｌ，　蒸水　９　Ｌ，混匀瞬时离心后进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ反应程序　为：９５℃５　ａｉｒｎ，１个循环；９４　ｃＣ　ｌ　ｒａｉｎ，５３　ｃＩｃ　１　ｍｉｎ，７２　ｑＣ　１　ｍｉｎ，３５个循环；７２℃最后延伸１０ｍｉｎ，１个循环；　２０００　ｂｐ　１０００　ｂｐ　７５０　ｂｐ　５００ｂｐ　４℃保存。反应结束后，取５　ＬＰＣＲ产物用ｌ％琼脂　糖凝胶（含０．５　Ｉｘｇ／ｍＬＥＢ）进行电泳检测。　１．４．４病毒的分离与培养：将ＰＣＲ鉴定结果为　ＰＣＶ一２感染阳性的病料剪成小块并研碎后．加入少　量ｌ６４０培养液稀释，反复冻融３次。融化后，５　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心ｌ０　ｒａｉｎ，取上清液，加入双抗至终浓度为　２５０　ｂｐ　１００ｂｐ　Ｏ　，‘ｌ　吣　０　０Ｍ：ＤＩ　２０００　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１：以第６代ＬＮ细胞毒总ＤＮＡ　为模板的ＰＣＲ产物：２：阴性对照　圈２　ＬＮ株ＰＣＶ一２全基因组ＰＣＲ产物电泳结果　１　２　３　Ｍ　＿＾　１　０００　ＩＵ／ｍＬ，３７℃作用２　ｈ。经０．２２　ｍ的细菌滤　器过滤除菌后接种ＰＫ一１５细胞．３７℃吸附１．５　ｈ后　弃Ｉ：清液，加入适量的含３００　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｄ一氨基葡萄　糖和２％小牛【０【清的ＲＰＭＩ一１６４０维持液，继续培养　７２　ｈ后收获病毒，继续盲传６代。将分离到的ＰＣＶ一　２毒株命名为１　Ｎ　１．４．５病毒Ｉ）ＮＡ的抽提：将ＬＮ分离株细胞毒冻融　３次以裂解细胞，然后提取细胞毒的ＤＮＡ，方法同　１．４．２。　１．４．６　ＰＣＶ一２　ＬＮ株全基冈组的扩增：以提取的细　胞毒ＤＮＡ为模板，用引物Ａ　、Ａ：扩增分离毒株ＬＮ　的全基因组，ＰＣＲ反应体系、反应条件及ＰＣＲ产物　电泳检测方法同１．４．３。　Ｍ：ＤＩ　２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１－２：　阴性对照　阳性质粒的　液：３：　１．４．７全基因的克隆与测序：按照ＤＮＡ凝胶回收　图３阳性重组质粒的菌液ＰＣＲ产物电泳结果　试剂盒说明书，回收、纯化特异的ＤＮＡ条带。选择　质粒ＰＣＲ鉴定结果和酶切鉴定结果均为阳性的重　特异性引物，以提取的ＰＭＷＳ疑似患病仔猪病料总　ＤＮＡ为模板，采用ＰＣＲ技术成功地扩增ｆｆＪ　ｌ条约　５０１　ｂｐ的片段（见图１），与预期扩增片段大小相　吻。　组质粒送大连宗生物工程有限公司测序。　２　结果　２．１　病料中ＰＣＶ一２的ＰＣＲ检测　以Ｐ。和Ｐ　为　２．２重组质粒的克隆及鉴定　６　ｍ　畜牧与饲料科学　第３６卷　０　０　∞　∞∞∞　∞　２　１　７　２　ｌ　ｂ　ｌ　２　３　Ｍ　１、第２泳道），与预期大小相符。　２．２．３重组质粒的ＰＣＲ及酶切鉴定：以阳性重组　ｐ　ｂｂｐ　ｐ　ｐ　ｐ　ｐ　ｂ　ｂｂ　菌的质粒ＤＮＡ为模板，Ａ　和Ａ　为引物，进行质粒　ＰＣＲ鉴定，获得了１条长约１　７００　ｂｐ的特异性条带　（见图４，第ｌ泳道），与预期大小相符。提取的重组　质粒经ＳａｃⅡ酶切后，获得了２条特异性条带（见图　４，第２泳道），其中１条带为载体质粒，大小约为　３　０００　ｂｐ，另１条带为所克隆的ＰＣＶ一２全基因组片　段，大小约为１　７００　ｂｐ，与预期结果相符；重组质粒　ｍ：ＤＬ　２０００　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；Ｍ：　一　Ｄ　Ｔ１４　Ｉ　ｄｉｇｅｓｔ；１：阳性　重组质粒ＰＣＲ产物；２：阳性重组质粒ＳａｃⅡ酶切产物；３：阳　性重组质粒Ｓｄ　Ｉ酶切产物　图４阳性重组质粒ｐＧＥＭ—ＰＣＶ一２　的ＰＣＲ及酶切产物电泳结果　经Ｓｏｌ　Ｉ酶切后．获得了１条大小约为４　７００　ｂｐ的　条带（见图４，第３泳道）。结果表明，ＰＣＶ一２全基因　组成功地被克隆至ｐＧＥＭ—Ｔ　Ｅａｓｙ载体中，将含有　目的基因片段的阳性重组质粒命名为ｐＧＥＭ—ＰＣＶ一　２。　２．２．１　ＰＣＶ一２全基因组的扩增：以Ａ　和Ａ２为特异　性引物。以提取的第６代ＬＮ细胞毒总ＤＮＡ为模　板，采用ＰＣＲ技术扩增出１条大小为１　７００　ｂｐ左　２．３　ＰＣＶ一２全基因组的序列测定　将阳性重组质　粒ｐＧＥＭ—ＰＣＶ一２送至测序公司．进行ＰＣＶ一２全基　右的片段（见图２），与预期扩增片段大小相符。　２．２．２重组质粒的菌液ＰＣＲ鉴定：挑取单个白色　因组的序列测定。测序结果表明，ＰＣＶ一２　ＬＮ株的全　基因组大小为１　７６７　ｂｐ。测序结果见图５。　３讨论　菌落接种子ＬＢ液体培养基中，振荡培养过夜。以　Ａ　和Ａ　为引物，进行重组质粒的菌液ＰＣＲ鉴定。　ＰＭＷＳ是影响世界养猪业健康发展的重要传　染病之一．ＰＣＶ一２是引起该病的主要病原，但不是　唯一病原，ＰＣＶ一２单独感染可出现轻微的ＰＭＷＳ　症状。该研究成功地从ＰＭＷＳ疑似患病仔猪的脾脏　Ａ　阳性重组质粒的菌液ＰＣＲ产物电泳结果见图３。由　图３可知．以含有阳性重组质粒的菌液ＤＮＡ为模　板．扩增出了１条ｌ　７００　ｂｐ左右的特异性条带（第　ＧＣＧＧＣＡ￣ＡＴＧＧＡＡ　ＣＣＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＡＣＣＣＡ　Ａ＝玛　盯ＴＩ：ＡＴＴＧＴＩ　ＧＣＧＡＧＧＡＣＫ？＇，ＧＴＡＡＴＧＡ　耵ＣＧＣＴＡＡｒｉＴＩＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＡＡＣＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡＧＴＧ　ＣＣＴＧＴＣ＇’Ａ　Ａ　门＇ＩｌＧＣＡＧＡＣＣＣＧＧＡＡＡ０ＣＡＣＡＴＡＣＴＧＧＡＡＡ　ｒＩ　ｅＣＡＴＧ　ＧＡＣＴＧＴＧＴＧ　ＴＴａ　｝Ａ　Ａ１℃　Ｇ　Ａ　～　Ａ　玎Ａ　ＡＡＧＡＡＴＣｒＣＴＡＣＡＧＡＡＣＡＡＴＣＣＡＣＧＧＡＧＧＡＡ￣ＣＡＧＴＴＣＧＴＣ　ＣＴｌＧＡＧ１℃ＴＩ＿ｒｒＴ１＝ＡＴＣＡＣＴＩＣＧＴＡＡＴＧ　Ｇ１　《粥ＧＧＴＣＴｎ：ＡＡＧ　兀　ＡＡＴＴＣＴＣＴＧＡＡＴＴＧＴＡＣＡＴＡＣＡＴＧＧＴ　Ｇ　∞ｅＩ　［＝Ａ　蟠＇ＡＣＴＧＴＩＴＴＣＧＡＡＣＧＣＡＧＴＧｃＣＧＡＧＧＣＣ　ｏＧＴ０ＧＴＣ　玎Ｇ　ｒＧＧＴｒＧＧＡＡ（Ｉ１ｆＡ　．Ａ　。Ｊ　胡１ＡＧ＂ＩＧＧ　ＡＡＴＣＴＡＯＧＡＣＡＧＧ＿ＴＴｎ３ＧＧＧＧ＂ＥＡＡＡＧＴＡＧＣＧＧＧＡＧＴＧＧＴＡＧＧＡ　ＧＧ＾－６ＧＡＧ豇　－ｒｎＡＣ　硝ＬＧＧＧＧＴＣ　瑙ＬＧＧ蕾ＧＡ｜　ＧＧＣＴＧ蕾　３ＯｅＴＩ１．ＧＴＩ．ＡＣＡＡＡ　ＡＡＴＩ℃ＡＡｅＣｒＩｌＡ　Ａ　岛ＧＧ鸟ＧＧＧＣＧＴｒＩ１　ＡＣＴＧＴＧＧＴＩ℃ＧＣＴｒＧＡＴＡＧ．Ｉ．Ａ　ＡＧＣＧＧ１Ｉ＝ＡＡＣＧＧＴｏＧＣＧ　Ｇ　ＴＣ．Ｉ℃ＣＧｏＴＡＡ　图５　ＬＮ株ＰＣＶ一２全基因组测序结果　９４　畜牧与饲料科学　第３６卷　Ｎｏｒｔｈ　Ｉｓｌａｎｄ　ｏｆＮｅｗＺｅａｌａｎｄ［Ｊ］．ＮＺ　Ｖｅｔ　Ｊ，２００８，５６（５）：　２１８－２２１．　ｆｏｒ　ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ｇｒｏｕｐ　ａ　ｒｏｔａｖｉｒｕｓ　ｂｙ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ｃａｐｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｔｙｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００３，４１（１１）：５１５３—５１５８．　［１９］　程娟，孙茂盛．轮状病毒检测技术的研究进展［Ｊ］．中国　生物制品学杂志，２００９，２２（６）：６２２—６２４．　杨少华，杨宏军，等．检测牛轮状病毒抗体间　［２０］　曹竹婷，李建军，等．我国部分地区牛轮状病　［２９］　常继涛，崔久辉，毒的病原学调查及一株Ｇ１０Ｐ［１１］型牛轮状病毒的分　离鉴定［Ｊ］．中国预防兽医学报，２００８，３０（１０）：７５５—　７５９．　接ＥＬＩＳＡ方法的建立［Ｊ］．中国预防兽医学报，　２００９，３１（３）：２１３—２１６．　　ａ１．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　［３０］　ＭＯＮＤＡＬ　Ａ，ＡＩＣＨ　Ｒ，ＭＡＪＥＥ　Ｓ，ｅｔｂｏｖｉｎｅ　ｒｏｔａｖｉｒｕｓ　Ｇ　ｓｅｒｏｔｙｐｅ　ｂｙ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　牛轮状病毒ＶＰ６蛋白间　［２１］　张怡婷，王洁清，张冠群，等．接ＥＬＩＳＡ检测方法的建立［Ｊ］．中国兽医科学，　２０１０，４０（１０）：１０３９—１０４３．　［Ｊ　３．Ｔｒｏｐ　Ａｎｉｍ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｐｒｏｄ，２０１２，４４（４）：７６３—７６７．　快速检测牛病毒性腹泻病毒　［３１］　郭锐，陈平，田永祥，等．实时荧光定量ＰＣＲ技术建立及应用『Ｊ］．湖北农业科　学，２０１１，５０（８）：１６４０—１６４３．　［２２］　侯美如，侯喜林，高俊峰，等．牛轮状病毒双抗体夹心　ＥＬＩＳＡ检测方法的建立［Ｊ］．黑龙江八一农垦大学学　报，２０１１，２３（２）：１９—２３．　刘加波，等．牛轮状病毒ＴａｑＭａｎ实时荧　［３２］　范晴，谢芝勋，光ＲＴ—ＰＣＲ快速检测方法的建立［Ｊ］．中国畜牧兽医，　２０１　１，３８（４）：１０５—１０８．　Ｓ　Ｐ，ＤＥ　ＢＡＲＲＯＳ　Ｉ　ＮＵＮＥＳ．ｅｔ　［３３］　ＡＳＡＮＯ　Ｋ　Ｍ，ＤＥ　Ｓ０ＵＺＡ　ａ１．Ｍｕｈｉｐｌｅｘ　ｓｅｍｉ—ｎｅｓｔｅｄ　ＲＴ—ＰＣＲ　ｗｉｔｈ　ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　［２３］　康晓东，谢秀兰，吴韶儒，等．宁夏奶牛病毒性腹泻一　黏膜病血清学调查［Ｊ］．黑龙江畜牧兽医，２０１３（４）：　９０－９１．　ｅｒｉｎａｒｙ　［２４］　ＥＤＷＡＲＤ　Ｊ　Ｄ．ＪＡＭＥＳ　Ｎ　Ｍ．Ｆｅｎｎｅｒ　Ｓ　Ｖｅｔｉｎｔｅｒｎａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｆｏｒ　ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ［Ｍ］．４　ｅｄ．Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，２０１　１：　２８８－２９０．　ｃｏｒｏｎａｖｉｎｓｒ　ａｎｄ　ｇｒｏｕｐ　ａ　ｒｏｔａｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　２０１０，１６９（２）：３７５—３７９．　Ｍ，ＫＵＧＡ　Ｋ，ＭＩＹＡＺＡＫＩ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　［３４］　ＦＵＫＵＤＡ　Ｎ　Ｍ，ＫＨＡＵＬＩ—ＹＡＺＤＩ　Ａ，ＫＡＲＡＭＯＵＺＩＡＮ　［２５］　Ｇ０ＬＣＨＩＭ，ｅｔ　１．Ｌａｔｅｘ　ａｇｇｌｕｔｉａｎａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｓｉｎｇｌｅ—ｃｈａｉｎ　Ｆｖ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｎｅ—ｓｔｅｐ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ＰＣＲ　ｆｏｒ　ｓｉｍｕｈａｎｅｏｕｓ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｉｖｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｆｒａｇｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｓｃａｎｄ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，　２０１２，７５（１）：３８－４５．　ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｐａｎｅｌ　［２６］　ＣＨ０　Ｙ　Ｉ，ＫＩＭ　Ｗ　Ｉ，ＬＩＵ　Ｓ，ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ　ｄｉａｒｒｈｅａｌ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｉｎ　ａｄｕｌｔ　ｃａｔｔｌｅ［Ｊ］．Ａｒｃｈ　Ｖｉｒｏｌ，２０１２，１５７　（６）：１０６３—１０６９．　［３５］　王克伟，李玉峰，王先炜，等．猪繁殖与呼吸综合征病　毒和牛病毒性腹泻病毒双重ＲＴ—ＰＣＲ检测方法的建　ｆｏｒ　ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｊｏｒ　ａｇｅｎｔｓ　ｃａｕｓｉｎｇ　ｃａｌｆ　ｄｉａｒｒｈｅａ　ｉｎ　ｆｅｃｅｓ［Ｊ］．ｊ　Ｖｅｔ　Ｄｉａｇｎ　Ｉｎｖｅｓｔ，２０１０，２２（４）：　５０９—５１７．　立［Ｊ］．畜牧与兽医，２０１１，４３（１）：１－４．　谢芝勋，刘加波，等．牛病毒性腹泻病毒ＲＴ—　［３６］　范晴，ＬＡＭＰ检测方法的建立［Ｊ］．生物技术通讯，２０１０，２１　（２）：２４８—２５１．　［２７］　范晴，谢芝勋，刘加波，等．牛病毒性腹泻病毒和牛轮　状病毒ＴａｑＭａｎ二重实时荧光ＲＴ—ＰＣＲ检测方法的　建立［Ｊ］．中国兽医学报，２０１１，３ｌ（１０）：１４１４—１４１８．　［２８］　ＨＯＷＥ　Ｌ，ＳＵＧＩＡＲＴＯ　Ｈ，ＳＱＵＩＲＥＳ　Ｒ　Ａ．Ｕｓｅ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｒｏｕｐ　Ａ　ｂｏｖｉｎｅ　ｒｏｔａｖｉｎｓ　Ｇ６，ｒＧ８　ａｎｄ　Ｇ１０　ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　［３７］　李巍。李宁，袁万哲．牛轮状病毒ＲＴ—ＬＡＭＰ检测方法　的建立［Ｊ］．动物医学进展，２０１２，３３（５）：３９—４３．　谢芝勋，刘加波，等．牛轮状病毒三种核酸检测　［３８］　范晴，方法的比较［Ｊ］．中国动物检疫，２０１２，２９（２）：３８—４１．　（责任编辑：赵俊利）　。—’一。—。卜－—ｔ一　—十一　—ｔ一。。。十一－十一—’一。—’一。—十一－—’一－—’一－十一—十一。—十一＊　—卜－—’一－十一十。‘’一＊　。卜－十－十　（上接第６页）及淋巴结中分离到１株ＰＣＶ一２病毒。　为模板，扩增得到了该毒株的全基因组，并对其进　ＰＣＶ体外培养时．适于在具有旺盛增殖能力并处于　有丝过程中的细胞上复制。并且ＰＣＶ的复制　依赖于细胞周期Ｓ期表达的多种细胞蛋白及酶类。　该试验的维持液中添加了３００　ｍｍｏｌ　Ｄ一氨基葡萄　糖，既能有效地刺激病毒复制，又不影响细胞状态，　行了克隆和测序。测序结果表明，ＬＮ毒株的全基因　组大小为１　７６７　ｂｐ。该研究为进一步从分子水平研　究ＰＣＶ一２在河南省的流行、变异规律及其主要结　构基因的特性奠定了基础．也为河南省猪场中　ＰＣＶ一２感染的诊断及预防提供了试验依据。同时，　ＰＣＶ一２全基因组的获得，也为研究ＰＣＶ一２的ＯＲＦｓ　功能，探明其毒力及免疫原性特征，了解ＰＣＶ一２在　混合感染中的作用以及研发ＰＣＶ一２基因工程疫苗　等工作奠定了基础。　（责任编辑：赵俊利）　盲传６代后。ＰＣＲ检测仍为阳性。至于该分离毒株　能否在ＰＫ一１５上继续传代还有待进一步研究。　近年来研究发现，ＰＣＶ一２的致病谱不断扩大，　对于由其引起的相关疾病尚无有效的预防措施，因　此开展ＰＣＶ一２的研究工作具有重要意义。该研究　采用ＰＣＲ法。以ＰＣＶ一２　ＬＮ株第６代细胞毒ＤＮＡ