细菌的培养与分离技术
● 考点 ◇ 基本条件
◇ 细菌的接种与分离技术 ◇ 细菌培养的方法 ◇ 细菌的生长现象 ◇ 细菌L型的检查 【内容讲解】
细菌培养是将细菌接种到培养基内，并在适当的环境内，使细菌生长和繁殖。
分离培养是指从标本中培养出细菌或者从混有多种细菌的标本中将各个菌种分别同时培养出来。
一、基本条件 （一）细菌实验室 （二）无菌实验室 （三）基本设备和器具 （一）细菌实验室
标本接种、培养、分离、鉴定及药敏试验等工作都要在此完成。
1.细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。且室内禁用风扇，避免细菌的播散。 2.细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面lm处，每天开始工作前照射20min。对其消毒效果要定期检查，及时更换失效的灯管。 3.室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液洒溅时的及时消毒处理。同时还应备有供工作人员浸手用的盛有消毒剂的水盆、肥皂及自来水源等。
4.室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少一周用消毒剂擦洗l次。 5.对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应明显分开并放在指定位置。同时要对用过的物品及时进行灭菌处理。
6.细菌室根据当地的气温特点，安装空调机，以适合细菌实验工作。同时室内应设置必要的消防设备。 （二）无菌实验室
无菌实验室是细菌实验室内用于无菌操作的小室，其内部装饰、消毒条件要求更严格。 1.无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。 2.用前应以紫外线消毒30min，定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。
3.在无菌室中一般仅限于分装无菌的培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他操作。
4.无菌室内应仅限操作人员进入，而且进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操作时戴口罩，随时保证室内的无菌状态。
5.条件有限的实验室，可用超净工作台代替无菌实验室进行相应的操作。超净工作台应选择垂直气流通风方式。
6.无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。 （三）基本设备和器具
温箱、C02培养箱、厌氧培养设备； 显微镜；
高压蒸气灭菌器、干烤箱；
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冰箱和冷藏柜；
接种器具，包括接种环和接种针；
pH计；火焰灯或酒精灯；平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。
二、细菌的接种与分离技术
选择好合适的培养基，根据待检标本的来源、培养目的及所使用培养基的性状，采用不同的接种方法。
接种分离法 用途 连续划线分离法 主要用于杂菌不多的标本。 平板划线分离法 分区划线分离法 适用于杂菌量较多的标本。 斜面接种法 穿刺接种法 倾注平板法 涂布接种法
三、细菌培养的方法 （一）需氧培养法 （二）二氧化碳培养法 （三）厌氧培养法 （一）需氧培养法
临床细菌室最常用的培养方法，适于一般需氧和兼性厌氧菌的培养。 置于35℃温箱中孵育18～24h。 （二）二氧化碳培养法
有些细菌初次分离培养时须置5%～l0%C02环境才能生长良好。
1.二氧化碳培养箱：是一台特制的培养箱，既能调节CO2的含量，又能调节所需的温度。CO2从钢瓶通过培养箱的CO2运送管进入培养箱内，调节好所需CO2浓度自动控制器后，将接种好的培养基直接放入培养箱中培养即可。适于大型实验室应用。
2.烛缸法：将已接种好的培养基置干燥器内，并放入点燃的蜡烛。干燥器盖的边缘涂上凡士林，盖上盖子，烛光经几分钟后自行熄灭，此时干燥器内CO2含量约占5%～10%，然后将干燥器放入35℃温箱内培养。培养时间一般为18～24h，少数菌种需培养3～7d或更长。
3.化学法：按每升容积加入碳酸氢钠0.4g和浓盐酸0.35ml的比例，分别置于容器内。 （三）厌氧培养法
适用于专性厌氧菌和兼性厌氧菌的培养。 常用的厌氧培养法有：
①疱肉培养基法；②焦性没食子酸法；③厌氧罐法；④气袋法；⑤厌氧手套箱法。
四、细菌的生长现象
（一）细菌在固体培养基上的生长现象 （二）细菌在液体培养基中的生长现象 （三）细菌在半固体培养基中的生长现象
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要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。 此法主要用于半固体培养基、明胶及双糖管的接种。 测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数时常用此方法。 常用于纸片法药物敏感性测定，也可用于被检标本中的细菌计数。 液体接种法（避免气溶胶的产生） 多用于一些液体生化试验管的接种。 ·
（一）细菌在固体培养基上的生长现象 1.观察菌落 2.血琼脂上的溶血 3.气味 4.色素 1.观察菌落
菌落特征包括大小、形状、突起、边缘、颜色、表面、透明度和粘度等。 根据细菌菌落表面特征不同，可将菌落分为三型： （1）光滑型（S型）菌落 （2）粗糙型（R型）菌落 （3）粘液型（M型）菌落 2.血琼脂上的溶血
α溶血：又叫草绿色溶血，菌落周围血培养基变为绿色环状。 β溶血：又称完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的环。
γ溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化；红细胞没有溶解或无缺损。 双环：上层溶血环，内层为β溶血，外层为α溶血。如产气荚膜梭菌。
3.气味
通过某些细菌在平皿培养基上代谢活动产生的气味，有助于细菌的鉴定。
如铜绿假单胞菌（生姜气味）、变形杆菌（巧克力烧焦气味）、厌氧梭菌（的恶臭味）、放线菌（泥土味）等。
（二）细菌在液体培养基中的生长现象 浑浊生长：大多数细菌。
沉淀生长：少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌。
菌膜生长（表面生长）：专性需氧菌如枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌。 （三）细菌在半固体培养基中的生长现象 半固体培养基用于观察细菌的动力。
◇ 有鞭毛的细菌除了在穿刺接种的穿刺线上生长外，在穿刺线的两侧均可见羽毛状或云雾状浑浊生第 3 页 共 6 页
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长，为动力阳性。
◇ 无鞭毛的细菌只沿穿刺线呈明显的线状生长，为动力试验阴性。
五、细菌L型的检查
表现为形态多形性、染色不确定性、可滤过性、渗透压敏感性，生化反应减弱特性以及对β-内酰胺类和其他作用细胞壁抗生素的抵抗性。 1.标本采集
应尽量采集无杂菌污染的组织或体液标本。
胸水、腹水及尿液标本，应加20%蔗糖无菌溶液，以保持高渗；血液标本应接种高渗肉汤增菌培养。 2.培养方法
（1）L型检查程序：
将标本接种到高渗肉汤增菌培养1～7天，然后转种L型平板和血平板37℃培养2～7天。
典型菌落为“荷包蛋”样，但从患者标本中新分离的L型菌落常不典型，多呈颗粒型菌落，涂片染色为多形性。
（2）检验报告：
①血平板无菌生长，L型平板有菌落生长，可报告检出细菌L型；
②血平板中菌落细小，不易刮下。涂片检查细菌呈多形性，细胞壁缺损，L型平板中有L型菌落，报告检出L型；
③血平板及L型平板均有菌落生长。涂片有原菌及L型两种形态特征，可报告细菌型及L型同时存在，并分别作药敏试验以供临床用药参考。
【例题】单个细菌在固体培养基上生长可形成 A.菌丝 B.菌落 C.菌团 D.菌苔
E.菌膜
[答疑编号5023090101]
【正确答案】B
【例题】尿液标本作L型菌培养时，培养基中加入20%蔗糖的原因是 A.提供高营养 B.使尿中蛋白质变性 C.稀释尿液 D.保持高渗环境 E.中和尿液的酸度
[答疑编号5023090102]
【正确答案】D
【例题】多用于含细菌量较多的标本的接种方法是 A.分区划线分离法
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B.琼脂斜面培养基接种法 C.半固体培养基接种法 D.液体培养基接种法 E.倾注平板法
[答疑编号5023090103]
【正确答案】A
【例题】关于平板划线分离培养法，叙述错误的是 A.适用于临床标本的分离培养
B.目的是使标本中的细菌各自形成单一菌落 C.常用划线方式为平板分区划线 D.接种细菌越多越好 E.接种时斜持平板（45°） [答疑编号5023090104]
【正确答案】D
【例题】下列细菌实验室一般注意事项，错误的是 A.穿着专用白大衣、帽 B.操作中不应谈话
C.养成在室内手不触及口、面、发的习惯 D.除接电话等紧急情况下，离室前必须消毒液洗手 E.室内不准跑动，以免引起风动 [答疑编号5023090105]
【正确答案】D
【例题】下列方法与检查细菌动力无关的是 A.压滴法 B.鞭毛染色 C.半固体穿刺 D.革兰染色
E.悬滴标本镜检
[答疑编号5023090106]
【正确答案】D
本章小结：
一、细菌分离培养的基本条件 二、细菌的接种与分离技术 三、细菌培养的方法
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四、细菌的生长现象 五、细菌L型的检查
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