玉米中QM同源基因的克隆及其差异表达分析

ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9

http://www.chinacrops.org/zwxb/

E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01439

玉米中QM同源基因的克隆及其差异表达分析

王会伟 李洪杰 朱振东 武小菲 王晓鸣*

中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程, 北京 100081

摘 要: 利用cDNA-AFLP和5′ RACE技术在玉米自交系黄早四Ht2上分离并克隆了QM(编码核糖体蛋白L10)同源基因(命名为ZmQM)。其cDNA全长为967 bp, 开放阅读框为738 bp。该基因编码245个氨基酸的ZmQM蛋白, 分子量为27.78 kD, 等电点为10.69, 预测含蛋白酶C磷酸化位点、N-酰基化位点和酰胺化等位点。玉米ZmQM蛋白与包括人类等l3个物种QM蛋白的同源性比较发现, 氨基酸序列相似性为66%~92%。RT-PCR分析表明, 在接种玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum) 1号小种12 h后, 黄早四Ht2中ZmQM基因表达量较黄早四中明显上调, 推测ZmQM基因可能参与黄早四Ht2对玉米大斑病菌1号小种的抗性反应。

关键词: QM基因; 核糖体蛋白L10; ZmQM基因; 黄早四Ht2; Exserohilum turcicum

Cloning and Differential Expression of QM-Like Protein Homologue from Maize

WANG Hui-Wei, LI Hong-Jie, ZHU Zhen-Dong, WU Xiao-Fei, and WANG Xiao-Ming*

Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement (NFCRI), Beijing 100081, China

Abstract: A full-length QM-like cDNA (designated ZmQM) was cloned from maize (Zea mays L.) leaf tissues using cDNA am-plified fragment length polymorphism (cDNA-AFLP) and rapid amplification of cDNA ends (RACE) techniques. The expression of ZmQM was examined in leaves of the Ht2 isogenic lines Huangzaosi and HuangzaosiHt2 carrying gene Ht2 for resistance to northern corn leaf blight after inoculation with race 1 of Exserohilum turcicum (Pass.) Leonard et Suggs. Gene ZmQM contains an open reading frame 738 bp in length, which encodes 245 amino acids with a predicted molecular weight of 27.78 kD and an isoelectric point of 10.69. Scanning PROSITE motifs indicated that the amino acid sequence of ZmQM protein includes a Ribo-somal protein Ll0e signature, an N-glycosylation site, four protein kinase C phosphorylation sites, a casein kinase II phosphoryla-tion site, a tyrosine kinase phosphorylation site, an N-myristoylation site, and an amidation site. The nucleotide sequence of ZmQM shared 66–92% identity to QM genes isolated from other species. RT-PCR analysis showed that the expression of gene ZmQM was up-regulated in Huangzaosi Ht2 at 12 h after inoculation with race 1 of E. turcicum compared with that in Huangzaosi. By inference, ZmQM protein may be involved in response of HuangzaosiHt2 to inoculation by E. turcicum race 1. Keywords: QM gene; Ribosomal protein L10; ZmQM gene; Huangzaosi Ht2; Exserohilum turcicum

玉米大斑病(northern corn leaf blight, NCLB)是由玉米大斑突脐蠕孢菌[Exserohilum turicicum (Pass.) Leonard et Suggs]引起的, 是玉米上重要的叶部病害。防治玉米大斑病最为经济、安全、有效的方法是种植抗病品种。近年来, 随着植物分子生物学技

术的发展和应用, 农作物分子育种成为作物遗传育种新的生长点。因此, 对抗病基因的克隆和功能的研究十分重要。

自从1961年Hooker发现并鉴定出Ht1基因后[1], 国内外许多学者在大斑病抗性基因的发掘、鉴定和

本研究由农业部作物种质资源保护项目(NB08-2130135-(25-30)-21)和国家科技支撑计划项目(2006BAD08A06)资助。 通讯作者(Corresponding author): 王晓鸣, E-mail: wangxm@mail.caas.net.cn

*

第一作者联系方式: E-mail: whuiweiw@163.com

Received(收稿日期): 2009-02-10; Accepted(接受日期): 2009-03-14.

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定位方面做了大量工作。迄今, 已报道了Ht1[1]、Ht2[2]、Ht3[3]、HtN[4]、HtM[5]、HtP[6]、ht4[7]和rt[6]等8种大斑病抗性基因, 并对Ht1、Ht2、Ht3和HtN进行了连锁图定位或者原位杂交定位, 部分标记已经应用于品种抗病基因检测。但有关大斑病抗性基因或其抗性相关基因的克隆未见报道。

Ht2是一个发现较早, 研究较多的大斑病抗性基因, 且对目前我国玉米大斑病原菌优势小种——1号小种[8](毒力公式Ht2Ht3HtN/Ht1)具有抗性。因此, Ht2基因对玉米抗大斑病育种具有重要的意义。本研究利用cDNA-AFLP技术分析了玉米近等基因系黄早四和黄早四Ht2受玉米大斑病菌1号小种侵染后的差异表达, 从黄早四Ht2上获得了QM基因的相似序列(GenBank登录号为U06108), 利用5′RACE技术获得了其全长cDNA, 命名为ZmQM, GenBank登录号为FJ600320, 对其编码的蛋白质性质进行了分析, 并利用RT-RCR技术分析了玉米QM基因在黄早四和黄早四Ht2接种玉米大斑病菌1号小种后的表达情况。

方法提取总RNA, 参照cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, 中国大连)提供的方法合成双链cDNA。

1.3 cDNA-AFLP分析及差异条带序列相似性分析

采用Bachem等[9]所述的方法进行cDNA-AFLP分析。对差异表达条带进行回收, 并克隆到pGM-T (Tiangen, 中国北京)载体上, 送北京三博有限公司测序。获得的序列运用Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/blast.cgi)进行相似性搜索。共发现了86条差异条带, 其中编号为45的序列与其他物种的QM基因具有一定的相似性, 命名为mQM。

1.4 利用5'RACE技术克隆mQM的全长cDNA

(ZmQM)

参照5'-full RACE Kit (TaKaRa, 中国大连)提供的方法。根据mQM的核苷酸序列, 运用Primer 5.0分别设计特异性外侧引物和内侧引物及5'-full RACE Kit提供的5'RACE外侧引物和内部引物(表1)。扩增出的产物克隆到pGM-T (Tiangen, 中国北京)载体后送北京三博有限公司测序。

1.5 ZmQM的生物信息学分析

用ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov /gorf/gorf.html)对ZmQM的开放阅读框进行预测, 并推导出ZmQM氨基酸序列。利用Clustalx软件(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)比较ZmQM和其他物种QM蛋白氨基酸序列相似性, 并运用InterPro- Scan (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)、PROSITE (http://www.expasy.ch/prosite/)、ProtParam (http://ex- pasy.org/tools/protparam.html)和SOPMA (http://npsa- pbil.ibcp.fr/)等生物信息学软件分别对ZmQM蛋白的结构域、功能位点、氨基酸组成、等电点、分子量、电荷分布、亲水性和二级结构等特性进行分析。

1 材料与方法

1.1 玉米种植与取样

供试玉米为黄早四(HZS)和黄早四Ht2 (HZSHt2)近等基因系。在(30±3)℃的温室中, 待幼苗生长至五叶期时, 选取在PDA平板培养基上生长1周且产孢好的玉米大斑菌(E. turcicum) 1号小种, 用打孔器取直径1 cm的菌饼分别接种于玉米第4叶上, 在每个叶片中脉的一侧接3个菌饼, 分别于接种后0、3、6、12、24、48和72 h取叶片中脉另一侧组织, 迅速放入液氮中, 然后保存于−80℃冰箱中备用。

1.2 RNA的提取与双链cDNA合成

参照TaKaRa公司的RNAiso Reagent Kit提供的

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences used in this study

引物名称 Primer

特异外侧引物 Special outer primer 特异内侧引物 Special inner primer 5'RACE外侧引物 5'RACE outer primer 5'RACE内侧引物 5'RACE inner primer

引物序列 Sequence (5'–3')

AGGAACGACTGTTTGGTG GCAAGTTCACATAAGGCAC CATGGCTACATGCTGACAGCCTA

CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG

mzACTIN-32F GTGACAATGGCACTGGAATG mzACTIN-741B GACCTGACCATCAGGCATCTC

1.6 RT-RCR分析

采用RT-RCR技术分析ZmQM基因在黄早四和

黄早四Ht2上的表达差异, 同时分析ZmQM基因在黄早四Ht2受病原菌处理不同时间后的表达差异,

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对照为清水处理后的黄早四和黄早四Ht2。以ACT3[10] (mzACTIN-32F和mzACTIN-741B)作内参对照, 引物序列见表1。ZmQM基因的扩增引物与5' RACE获得有效扩增的引物一致。

2 结果与分析

2.1 mQM的全长cDNA克隆与序列分析

利用AFLP-cDNA技术, 在接种玉米大斑病菌1号小种后, 与黄早四相比, 黄早四Ht2上共发现了86条差异条带(图1), 经回收、测序及Blast比对, 发现条带45与玉米60S核糖体蛋白L10-3的1个mRNA (GenBank登录号为EU9734) 3'末端序列相似性为99%。因此, 采用5' RACE技术扩增条带45的全长cDNA。利用特异性内侧引物和5'RACE内侧引物组合获得了有效扩增, PCR产物经克隆、测序分析, 得知其大小为967 bp。采用ORF Finder预测, 发现该序列从32位到769位核苷酸为一个开放阅读框, 长738 bp, 编码245个氨基酸(图2)。进一步通过Blastn比对分析, 表明该序列与小麦、水稻等物种的QM蛋白基因序列高度相似, 且开放阅读框范围基本一致, 因此认为克隆到的基因具有完整的开放阅读框, 命名为ZmQM。

图1 用cDNA-AFLP分析接种玉米大斑病菌1号小种不同时间后黄早四Ht2和黄早四中mQM的表达差异 Fig. 1 Differential expression of mQM analyzed by cDNA-AFLP between HuangzaosiHt2 and Huangzaosi inocu-lated with race 1 of Exserohilum turcicum

R: 黄早四Ht2; S: 黄早四。R: HuangzaosiHt2; S: Huangzaosi.

图2 ZmQM基因序列及推导的氨基酸序列

Fig. 2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of gene

ZmQM cloned from maize

* 表示起始密码子, ***表示终止密码子; 核酸序列中加下画线的碱基分别代表5′和3′端的非转录区域

Start and stop codons are indicated by single- and triple-asterisk, respectively. Nucleotides sequences with underline represent the 5′

and 3′ untranslated regions.

应用InterProScan搜索发现, ZmQM编码的多肽中含有一个典型的L10结构域。根据Farmer等[11]描述的L10结构域特点, 对ZmQM编码的多肽进行结构分析, 证明在这个多肽中: 从26位氨基酸至56位氨基酸为第1个碱性氨基酸区域B1, 173位到197位为第2个碱性氨基酸区域B2, 59位到69位含有11个带电荷的氨基酸区域C, 80位到93位为1个保守的酸性氨基酸区域A, 173位到197位为B1区域, 从127位氨基酸至147位氨基酸为富含甘氨酸和丙氨酸区域G/A, G/A区域具有结合核苷酸的功能(图3)。从GenBank中搜索了其他13个物种中的L10结构域的序列, 经过序列比对, 发现这些序列与ZmQM的氨基酸序列相似性最高的为水稻(Oryza sativa ssp. indica cultivar-group, 92%), 最低的为玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis, 66%)(图2)。

通过ProtParam软件分析, 预测ZmQM基因编码的多肽分子量为27.78 kD, 等电点为10.69, 其氨

基酸组成为Asp和Glu酸性氨基酸残基数比例为19%、碱性氨基酸Arg和Lvs残基数比例为54%的特点, 表明ZmQM蛋白为碱性蛋白质。同时, 对多肽的疏水/亲水性分析结果显示, 其疏水性平均值(average of hydropathicity)为–0.606。与其他已知蛋

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图3 ZmQM与其他物种的13个QM基因的氨基酸序列同源性比较

Fig. 3 Alignment of deduced amino acid sequences of ZmQM gene from Zea mays with 13 QM genes from other species

*表示完全一致的序列, B1和B2为碱性氨基酸区域, C为带电荷的氨基酸区域, A为酸性氨基酸区域, G/A为富含甘氨酸和丙氨酸区域。 Identical residues between sequences are indicated with an asterisk. B1 and B2 represent basic domains. A: acidic domain; C: charged cluster; G/A: glycine alanine loop. Branchiostoma floridae: XP_002202219; Homo sapiens: AAB27665; Oryza sativa: CAA57339; Caragana jubata: AAT74554; Camellia sinensis: AAT68777; Populus trichocarpa: ABK92819; Solanum melongena: P93847; Elaeis guineensis: ACF051; Arabidopsis thaliana: NP_563945; Physcomitrella patens: XP_001782980; Triticum aestivum: AAP80617; Chlamydomonas reinhardtii:

XP_001694428; Ustilago maydis: XP_759469.

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白比较, ZmQM可能是一种可溶性蛋白。

通过搜索PROSITE数据库, 获得的ZmQM多肽序列中包含4个蛋白酶C磷酸化位点TRR (3~5)、SFR (9~11)、SVR (162~1)和SRK (193~195), 1个N-糖基化位点NVSS (84~87), 1个酪蛋白激酶II磷酸化位点SRAD (202~205), 1个酪氨酸激酶磷酸化位点RKGVDEFPY (65~73), 1个N-酰基化位点GMRGAF (139~144), 1个酰胺化位点MGRR (26~ 29), 此外还存在1个核糖体蛋白L10特征序列RGAFGKPQGTCARV (141~154)。运用SOPMA预测ZmQM蛋白的二级结构, 发现它存在7个α螺旋, 含11个β折叠和10个β转角。

2.2 玉米中ZmQM的差异表达分析

采用RT-PCR方法, 分析了ZmQM基因在黄早四和黄早四Ht2接种玉米大斑病菌1号小种后的表达水平。与清水处理后的黄早四和黄早四Ht2及玉米大斑菌处理后的黄早四相比, ZmQM基因在接种玉米大斑菌12 h后的黄早四Ht2中表达量明显上调(图4-A), 且在接种病原菌12~24 h达到高峰, 48 h出现下降趋势, 72 h后回复到与未接种对照植株基本一致的表达水平(图4-B)。据此推测, ZmQM基因在黄早四Ht2抗玉米大斑病菌1号小种过程中发挥重要作用, 并且在接种后12~24 h之间作用最强。

图4 用RT-PCR分析ZmQM基因的差异表达

Fig. 4 RT-PCR analysis of differential expression of gene

ZmQM in maize

HZS: Huangzaosi; HZSHt2: HuangzaosiHt2. A: differential ex-pression of gene ZmQM in HZS and HZSHt2;

B: differential expression of gene ZmQM in HZSHt2 at different

times after inoculation with race 1 of E. turcicum.

3 讨论

自1991年QM/RPL10基因报道以来, 已经从人类和许多动植物中克隆到了QM/RPL10基因, 并对其生物学性质与功能进行了研究, 发现QM蛋白具

有核糖体蛋白以外的许多功能, 如参与细胞生长、分化、发育和凋亡等基本生命活动[12-13]。在植物中, Rivera等[14]首次从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中克隆了QM基因, 迄今已从多种植物中克隆了QM基因, 但其功能仍在研究之中。在酵母(Saccharomy cescerevisiae)中过量表达番茄(Lycopersicon escu-lentum)的类QM蛋白, 可以调节细胞间脯氨酸的含量, 从而保护酵母细胞免受由过氧化氢、除草剂百草枯(Paraquat)和高温引起的活性氧积累而造成的伤害[15]。茶树(Camellia sinensis)中QM基因的转录水平在受到干旱胁迫和脱落酸处理后下调, 但受到赤霉素处理后上调, 表明QM基因对茶树的生长起促进作用[16]。Rocha等[17]认为QM蛋白作为由NIK(核穿梭蛋白互作激酶)介导的抗病毒信号途径下游的效应器发挥作用, 当QM基因缺失或突变后, 寄主植物对菜豆金色花叶病毒属病毒的抗性明显减弱。ZmQM作为一种类QM基因, 在玉米中可能参与黄早四Ht2对玉米大斑病菌1号小种的抗性反应。综上所述, QM基因在植物的抗逆反应中可能担负着重要的功能, 即QM基因可能是一类新的抗逆相关基因。

本研究中发现, ZmQM蛋白比玉米中已克隆QM蛋白(GenBank登录号为NP_001105355)和大多数其他物种的QM蛋白N端多出了25个氨基酸残基, 这使ZmQM蛋白(不稳定系数II = 44.61>40)与其他QM蛋白相比较稳定性降低。另外, 在25个氨基酸残基中还存在2个蛋白酶C磷酸化位点TRR (3~5)、SFR (9~11), 但这25个氨基酸残基的存在是否赋予了ZmQM蛋白的其他功能还有待进一步研究。

RT-PCR分析表明, 在接种玉米大斑病菌1号小

种12 h后, 黄早四Ht2中ZmQM基因表达量比黄早四明显上调。由于玉米大斑病菌1号小种对具有Ht1基因和不含任何Ht基因的玉米(如黄早四)具有毒力, 侵染后在叶片上形成典型的病斑, 并产生大量的分生孢子, 但对具有Ht2基因的玉米无毒力, 只引起褪绿坏死斑[18]。因此, ZmQM基因可能与Ht2基因的抗性表达密切相关, 即ZmQM基因可能通过自身的表达量来Ht2基因的表达, 或ZmQM基因的表达量受Ht2基因的反。ZmQM基因在由Ht2介导抗病反应中的位置及与其他Ht2相关基因的关系还有待进一步深入研究。

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4 结论

从玉米自交系黄早四Ht2中分离和克隆了QM同源基因, 命名为ZmQM, 其cDNA全长967 bp, 开放阅读框为738 bp, 编码245个氨基酸, 比大多数的QM蛋白N端多25个氨基酸残基。ZmQM基因在接种后的黄早四Ht2中表达量上调, 而上调时间出现在接菌后12~24 h。推测ZmQM基因在黄早四Ht2抗玉米大斑病菌1号小种过程中发挥重要作用。

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