叶绿体色素的提取、分离、定量及理化性质的鉴定
生命科学学院09生科基 朱文杰
实验目的：掌握提取和分离叶绿体色素的方法；掌握测定叶绿体色素含量的方法；熟悉叶绿体色素的理化性质及吸光特性；了解植物叶绿体色素组成及其与生境的相关性。
实验原理：叶绿体色素是吸收光能的重要物质，包括叶绿素和类胡萝卜。利用不同色素的极性不同可以用色谱分离法将其分离。不同的色素对光的吸收范围不同，因此我们也可以测量不同色素在不同波长光下的吸光值，即可用公式计算出其中各色素的含量。光对叶绿体色素有破坏作用，将叶绿体色素暴露于强光下，可以发现叶绿素被破坏，溶液颜色变化。。叶绿体色素分子吸收光后变为激发态，如能量不被光合作用利用，激发态变回到基态，放出波长较长的红光。叶绿素分子中卟啉环上的Mg处于不稳定的状态，可被H、Cu、Zn离子取代。叶绿素不溶于水，能溶于有机溶剂，且各色素的脂溶性不同，故可利用乙醇或丙酮提取，用不同的有机溶剂萃取或用色谱法进行分离。
实验步骤：分别选取2g左右新鲜菠菜和0.2g左右玉米幼株的叶片剪碎放入研钵中。在研钵中加入5ml丙酮以及少量的石英砂和氯化钙，充分研磨至无纤维装组织。过滤并转移动至量筒中，再用3ml丙酮冲洗研钵，最后加入丙酮定容至10ml作为备用提取液。
实验一：吸光值测定：取0.1 ml色素提取液，用80％丙酮稀释到3 ml ，测定663、5 nm 处的吸光值，根据公式计算叶绿素a、叶绿素b的含量。Chla（μg /ml）
=12.7 OD663－2.69OD5，Chlb（μg /ml）=22.9 OD5－4.68 OD663。
实验二：光破坏：取少量色素提取液并稀释3到5倍，分为2份，一份至于暗处，一份正对观察透射光，反身观察反射光，最后放在培养箱中的强光下放置2H。 实验三：铜带反应： 取少量色素提取液少许于试管中，一滴一滴加浓盐酸，直至溶液颜色出现褐绿色。然后加醋酸铜晶体少许，慢慢用水浴加热溶液，则又产生鲜亮的绿色。 实验四：皂化反应
取叶绿体色素提取液2 mL于大试管中，加入4mL乙醚，摇匀，再沿试管壁慢慢加人3mL蒸馏水，轻轻混匀，静置片刻。待溶液分为两层后用滴管吸取上层绿色层溶液，放入另一试管中，再用蒸馏水冲洗一、二次。在色素乙醚溶液中加入30％KOH－甲醇溶液，充分摇匀，再加入蒸馏水约3-5 mL，摇匀静置。 实验五：叶绿体色素分离：
圆盘分离：取圆形定性滤纸一张，用毛细管吸取叶绿体色素提取滴在圆形滤纸中心点样20次左右，在圆形滤纸中心戳一圆形小孔，将纸捻成灯芯状，一端插入圆形滤纸的小孔中，再往培养皿中加入适量的四氯化碳，使纸捻下端浸入推动剂中。迅速盖好培养皿。
条带分离：取条形滤纸一张，在离一端1cm左右处用铅笔轻轻划线。再用毛细管吸取色素提取在细线处划线。将纸条的另一端用大头钉钉在玻璃管橡皮塞上。长度为盖上橡皮塞滤纸下部刚好触底为宜。最后向管中加入四氯化碳盖上塞子，注意不要使液面高于铅笔划线处。
实验五：不同色素吸光值测定：将条形滤纸上的条带剪下来放入不同小试管中，均用80%丙酮洗脱后，最为分光光度计观测的预备液。 实验结果：
实验一：吸光值测定 项目 菠菜 玉米 OD663 0.353 0.359 OD5 0.123 0.096 Chla（μg /ml） Chlb（μg /ml） 4.152 4.301 3.615 0.518 稀释 倍数 30 5 鲜重（g） 2 0.2 由公式计算有〔Chla（μg /ml）=12.7 OD663－2.69OD5，Chlb（μg /ml）=22.9 OD5－4.68
OD663〕
菠菜：Chla（μg /ml）*0.1*30*10/2 Chlb（μg /ml）*0.1*30*10/2 玉米：Chla（μg /ml）*0.6*5*10/0.2 菠菜总叶绿素吸光光谱
菠菜（od玉米（od
值） 值）
400nm 0.424 410nm 0.53 420nm 0.577 430nm 0.688 440nm 0.609 450nm 0.467 460nm 0.447 470nm 0.397 480nm 0.267 490nm 0.127 500nm 0.047 510nm 0.007 520nm -0.003 530nm -0.004 540nm -0.003 550nm -0.002
560nm 0.003
570nm 0.019
580nm 0.025 590nm 0.028 600nm 0.036
610nm 0.056
620nm 0.063 630nm 0.055 0nm 0.083 5nm 0.123 0.096 650nm 0.169 660nm 0.319 663nm 0.353 0.359 670nm 0.251
Chlb（μg /ml）*0.6*5*10/0.2 菠菜（od值）0.80.6值0.4d菠菜（od值）o0.20-0.2nmnmnmnmnmnmnmnmnm004080206000406300444556667波长 680nm 690nm 700nm
0.044 -0.022 -0.034
实验二：光破坏
位于暗处的叶绿素提取液依然保持鲜绿色，置于强光下的叶绿色提取液最后呈暗橙黄色。这是因为叶绿素在光下接受电子会迅速从基态窜升至激发态,虽然还会马上回落成基态,但这个过程中会有90%的能量以热能的形式散失掉,并用剩余的10%左右的能量发出红色的荧光。经过一段时间的阳光照射,能量达到一定程度的损失,使剩余的能量所对应的波长不足以发出绿光,只够发出黄光. 实验三：铜带反应
当往叶绿素提取液中加入浓HCL时，叶绿素分子将受到破坏。主要是镁离子的缺失而形成去镁叶绿素，在加入铜离子并水浴加热的过程中，我们能看见液体重新恢复亮绿色。此时是因为铜离子与缺镁叶绿素结合而产生了铜带叶绿素。
实验四：皂化反应
第一次加入乙醚摇匀，再加入蒸馏水后，由于叶绿素分子溶于有机溶液的特性。我们可以看到溶液分为2层，上面为溶解有叶绿素的乙醚层，故为绿色。下层为水层，为白色或浅黄色。加入30％KOH－甲醇溶液后，叶绿素可与碱起皂化反应而形成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水，而类胡萝卜素不能发生皂化反应，其依然为脂溶性。故加入蒸馏水后下层为水层，为绿色，上层为黄色。
实验五：叶绿体色素分离
圆盘分离：我们在圆形滤纸上能看见4条清晰的环带，由于叶绿素与类胡萝卜素的基团不同，极性不同，所以迁移的速率也不同。从内到外依次为叶绿素B、叶
绿素A、叶黄素、胡萝卜素。具体见附图（一）。
条带分离：如上，我们可以看见从划线处往上有4条清晰地条带，从下到上依次为叶绿素B、叶绿素A、叶黄素、胡萝卜素。
将测量数据制表如下
400nm 410nm 叶绿色素叶绿色素
叶黄素 胡萝卜素
a b
0.663 0.254 0.022 0.05 0.857 0.224 0.033 0.062 420nm 0.882 430nm 1.032 440nm 0.719 450nm 0.301 460nm 0.216 470nm 0.216 480nm 0.16 490nm 0.093 500nm 0.059 510nm 0.056 520nm 0.056 530nm 0.062 540nm 0.056 550nm 0.059 560nm 0.067 570nm 0.097 580nm 0.114 590nm 0.109 600nm 0.124 610nm 0.173 620nm 0.185 630nm 0.158 0nm 0.1 5nm 0.215 650nm 0.318 660nm 0.729 663nm 0.809 670nm 0.65 680nm 0.18 690nm 0.039 700nm
0.023
0.374 0.034 0.446 0.043 0.426 0.054 0.487 0.043 0.573 0.035 0.397 0.05 0.182 0.042 0.079 0.022 0.06 0.005 0.05 0.001 0.047 0 0.052 0 0.054 -0.001 0.055 -0.002 0.057 -0.001 0.062 -0.002 0.087 0 0.082 0 0.088 0 0.088 0.002
0.087 0 0.099 0 0.17 -0.002 0.23 0.001 0.25 0.002 0.227 0.014 0.223 0.018 0.149 0.009 0.054 -0.002 0.014 -0.006 0.015
-0.006
0.076 0.0 0.097 0.096 0.087 0.082 0.078 0.043 0.019 0.006 0.001 0.001 0 -0.001 0 -0.001
0.001 0.002 0.002 0.005 0.003 0.003 0.003 0.006 0.01 0.025 0.029 0.019
0 -0.007 -0.006
按照上表做出吸光曲线 1.2 1 0.8叶绿色素a 0.6叶绿色素b 叶黄素0.4 胡萝卜素0.2 0 -0.2 波长 由上图可以看出，叶绿素A在440nm与680nm左右有最大吸收峰，叶绿素B在460nm与680nm左右有最大吸收峰，这两个波段为红橙光和蓝紫光。与教材内容符合。胡萝卜素和叶黄素可能由于浓度过低，吸收光不明显。 5.参考文献 1、《叶绿体色素的提取、分离、定量及理化性质的鉴定》 兰州大学生命科学学院植物生理学实验课件；
吸光值（OD）400n42m0n44m0n46m0n48m0n50m0n52m0n54m0n56m0n58m0n60m0n62m0nm0n65m0n66m3n68m0n70m0nm