中国生物制品学杂志2011年5月第24卷第5期ChinJBiologicalsMay2011，Vol.24No.5
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【基础研究】广东眼镜蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及其酶活性质
2郝彩1，
韩丽萍1蒋琳兰1
【摘要】目的从广东舟山眼镜蛇毒中分离纯化磷脂酶A（PLA2）组分，并分析其理化性质、酶活性质以2PhospholipaseA2，及影响其酶活力的因素。方法
采用化学沉淀、SephadexG-50凝胶过滤及UNDSphereS阳离子交换层析法对PLA2进行分
从广东舟山眼镜蛇毒中分离的PLA2蛋白浓度为
离纯化；采用BCA法测定其蛋白浓度，HPLC法测定其纯度，SDS-PAGE测定其相对分子质量，PLA2测定方法测定其活力；并考察反应温度、反应pH值及金属离子对酶活性的影响及其热稳定性。结果
0.6mg／ml，回收率为9.5％，HPLC纯度为99％，相对分子质量为14300，比活力为133μmol／（mg·min）；最适反应温度及pH值分别约为60℃和8.5；Ca2＋和Mg2＋可增强酶活力，K＋、Ni2＋、Fe2＋、Cu2＋、Zn2＋、Co2＋和Cr2＋对酶活力均有抑制作用；该酶具有较高的热稳定性。结论从广东舟山眼镜蛇毒中分离纯化出一种高纯度的PLA2，该酶具有较高的最适反应温度和热稳定性。【关键词】磷脂酶A2；眼镜蛇属；蛇毒；分离和提纯；酶活性
【中国图书分类号】R392-33【文献标识码】A【文章编号】1004-5503（2011）05-0575-04
Isolation，PurificationandEnzymaticActivityofPhospholipaseA2fromVen－omofGuangdongCobra（Najanajaatra）
HAOCai，HANLi-ping，JIANGLin-lan（DepartmentofPharmacy，GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand，Guangzhou510010，China）
【Abstract】ObjectiveToisolateandpurifyphospholipaseA2（PLA2）fromthevenomofGuangdongcobra（Najanajaatra）andanalyzeitsphysic-chemicalproperty，enzymaticactivityaswellasinfluencingfactorsoftheactivity．Methods
PLA2wasisolat－
edandpurifiedbychemicalprecipitation，SephadexG-50gelfiltrationandUNDSphereScationexchangechromatography，andde－terminedforproteinconcentrationbyBCAmethod，forpuritybyHPLC，forrelativemolecularmassbySDS-PAGE，forenzymaticac－tivitybyautomatictitration．Theinfluencesoftemperature，pHvalueandmetaliononenzymaticactivityaswellastheheatstabilityofPLA2wereevaluated．ResultsTheproteinconcentration，recoveryrate，HPLCpurity，relativemolecularmass，specificactivity，optimaltemperatureandpHvalueofPLA2isolatedfromthevenomofGuangdongcobrawere0.6mg／ml，9.5％，99％，14300，133μmol／（mg·min），about60℃andabout8.5respectively．Ca2＋andMg2＋increased，whileK＋，Ni2＋，Fe2＋，Cu2＋，Zn2＋，Co2＋andCr2＋inhibitedtheenzymaticactivityofPLA2．PLA2showedhighheatstability．ConclusionThePLA2withhighpurity，highoptimaltemperatureandhighheatstabilitywaspurifiedfromthevenomofGuangdongcobra．
【Keywords】PhospholipaseA2（PLA2）；Naja；Venom；Isolationandpurification；Enzymaticactivity
磷脂酶A（PLA2）是一类分布2PhospholipaseA2，广泛的酶家族，存在于各种动物组织，尤其是蛇毒、蝎毒、蜂毒等动物毒液和哺乳动物的胰脏分泌液中。PLA2的基本作用是催化甘油磷脂sn-2位上的酰键发生水解反应，产生溶血磷脂和脂肪酸，参与磷脂的代谢［1］。蛇毒磷脂酶A（2VenomphospholipaseA2，vPLA2）在结构和水解功能上与哺乳动物的分泌型PLA2非常相似，但其还具有某些重要的毒性作用（如神经毒性、出血毒性、肌肉毒性、心脏毒性等［2-3］）及多种其他生物学功能（如杀菌、诱导细胞凋亡、阻止HIV进入宿主细胞、引起水肿等［4-7］）。因此，深入研究蛇毒PLA2对其在制药领域的应用具有重要意
作者单位：1广州军区广州总医院药剂科（广州510010）；2华南
）．理工大学生物科学与工程学院（广州510006
通讯作者：韩丽萍，E-mail：hanliping＠163．com
义。本研究采用化学沉淀预处理结合分子筛层析和
阳离子交换层析，从广东舟山眼镜蛇毒中分离纯化出一种耐高温的PLA2，并对其理化性质及酶活性质进行鉴定。1.材料与方法1.1蛇毒
广东舟山眼镜蛇（Najanajaatra）蛇毒冻干粉（批号：20081005）由广州新源毒蛇养殖场提供，经广州医学院蛇毒研究所鉴定。1.2主要试剂及仪器
SephadexG-50凝胶、三氟乙酸（TFA）和乙腈（色谱纯）为Sigma公司产品；阳离子交换树脂UNDSphereTMS、BioLogicLP层析仪和UniversalHoodⅡ凝胶成像系统为Bio-Rad公司产品；BCA蛋白定量
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试剂盒为ThermoScientific产品；蛋白质marker为TaKaRa公司产品；其他试剂均为国产分析纯；Agi－lent1100LC高效液相色谱仪为Agilent公司产品。1.3PLA2的分离纯化
舟山眼镜蛇毒粗毒，按照文献［8］的方法进行预处理，预处理液上SephadexG-50（1.0cm×120cm）凝胶柱，用0.01mol／L的磷酸盐缓冲液（含0.2mol／LNaCl，pH7.2）洗脱，流速0.3ml／min；收集具有PLA2活性的主峰，再过UNDSphereS阳离子交换
），用0.05mol／L乙酸铵缓冲液柱（1.6cm×20cm
（pH5.8）及NaCl（0～1.0mol／L）线性梯度洗脱，流速0.7ml／min，收集具有PLA2活性的组分，浓缩、冻干，即得纯化的PLA2。
1.4PLA2蛋白含量及回收率的测定
采用BCA法测定PLA2的蛋白浓度。以牛血清白蛋白作为标准蛋白，稀释成系列浓度梯度，分别加入工作液混匀后，于37℃孵育30min，在562nm波长处测定吸光度值，以标准蛋白浓度为横坐标，A562值为纵坐标，绘制标准曲线。采用同样方法处理样品，测定吸光度，并计算回收率。1.5PLA2的纯度测定
采用HPLC法。色谱条件：AglientC18高效液相
）；流动相：A相为0.1％色谱柱（4.6mm×150mm三氟乙酸溶液，B相为含0.1％三氟乙酸的乙腈，B
相浓度梯度：0～10min，体积分数为10％，10～50min，体积分数为10％～50％；柱温30℃；进样量20μl，流速1ml／min；二极管阵列检测器，于波长214nm和280nm处检测并记录色谱行为。1.6PLA2的相对分子质量测定
用5％浓缩胶和15％分离胶，进行SDS-PAGE分析，测定PLA2的相对分子质量。1.7PLA2的活力测定
取1mol／LNaCl、0.01mol／LCaCl2、0.01mol／L去氧胆酸钠各20ml，加新鲜鸡蛋卵黄15g，混匀，用1mol／LNaOH调pH值至8.0，总体积定容至200ml。每次取底物混合液10ml，PLA2样品50μg，混匀同时计时，用0.02mol／L的KOH滴定混合液，维持pH值在8.0，通过中和所用KOH的量来计算放出的脂肪酸的量。PLA2活力以每毫克蛋白每分钟释放的脂肪酸表示，并计算酶活力回收率。1.8反应温度对PLA2活力影响的检测
取50μgPLA2，与10ml底物混匀，在不同温度37、45、50、60、70、80、90、100℃）下保温10min（25、
后，测定酶活力，酶活力最大时的温度即为酶的最适反应温度。
1.9反应pH值对PLA2活力影响的检测
取50μgPLA2，与10ml底物混匀，在不同pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0）下催化反应，60℃保温10min后，测定酶活力，酶活力最大时的pH值即为酶的最适反应pH值。1.10金属离子对PLA2活力影响的检测
取50μgPLA2与10ml底物溶液，分别加入不同的金属离子（Ca2＋、K＋、Fe2＋、Cu2＋、Mg2＋、Co2＋、Cr2＋、Ni2＋、Zn2＋），浓度均为10mmol／L，60℃保温10min后，分别测定酶活力。
1.11PLA2的热稳定性测定
PLA2分别于55℃和100℃保温不同时间后，取50μgPLA2与10ml底物混匀，60℃保温10min后，测定酶活力。2.结果
2.1PLA2的分离纯化
眼镜蛇毒粗毒预处理液经凝胶过滤后，共得到2个主峰，其中峰1具有PLA2活性，经阳离子交换
其中峰3具有PLA2层析进一步纯化后得到6个峰，
活性，见图1和图2。
0.0.0.0.0.3025201510
500400300200100
0
100
200
300时间（min）
400
500
600
0
mS／cmmS／cmAU0.05
0.00
图1眼镜蛇毒粗毒凝胶过滤图谱
Fig1.GelfiltrationofcrudevenomofNajanajaatra
0.100.08
500400300200100
0
50
100150200250300350
时间（min）
400450
0
AU0.060.040.020.00
图2凝胶过滤峰1的离子交换层析图谱
Fig2.Ionexchangechromatographicprofileofpeak1ingelfiltration（Fig1）
2.2PLA2的蛋白浓度及回收率
标准曲线的直线方程为：y＝0.9763x＋0.0743，
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R2＝0.9990。BCA法测定PLA2的蛋白浓度为0.6mg／ml，经计算PLA2的回收率为9.5％。2.3PLA2的纯度
PLA2样品经HPLC检测为单一峰，纯度为99％，达到色谱纯，见图3。
DAD1B，Sig＝214．16
Ref＝off600
500（SHEDU／10112003．D）
和Cr2＋对酶活力有较强的抑制作用，尤其是Cr2＋可使酶活力几乎丧失，见图7。
2.8PLA2的热稳定性
从热稳定性曲线可以看出，在55℃保温对酶活力影响较小，保温18h后酶活力才开始显著下降，24h后酶活力仍保留约36％；在100℃保温20min，酶活力可保留％，1h后酶活力迅速丧失，但未完全失活，说明该酶有较高的热稳定性，见图8。
mAU1520253035
脂肪酸释放量（μmol）400
300200100010
27．439806040200－20
蛇粗毒PLA2
时间（min）
图3PLA2的HPLC图谱Fig3.HPLCprofileofPLA2
2.4PLA2的相对分子质量
纯化的PLA2经15％SDS-PAGE分析，相对分子质量约为14300，见图4。
1
M
Mr97200
60044300
510时间（min）
1520
图5PLA2的活力曲线图Fig5.ActivitycurveofPLA2
70A脂肪酸释放量（μmol）60504030201000
20
40
60
80
100
120
290002010014300
1：PLA2；M：蛋白质marker
图4PLA2的15％SDS-PAGE分析Fig4.15％SDS-PAGEprofileofPLA2
反应温度（℃）
80脂肪酸释放量（μmol）B
2.5PLA2的活力
根据酶活力曲线（图5）的直线部分计算得出，
纯化的PLA2的比活力为133μmol／（mg·min），粗毒比活力为73μmol／（mg·min），活力回收率超过100％，见图5。
2.6反应温度及pH值对PLA2活力的影响
从不同温度和pH值的酶活力曲线可以看出，PLA2的最适反应温度约为60℃，最适pH值约为8.5，见图6。
2.7金属离子对PLA2活力的影响
试验结果显示，Ca2＋和Mg2＋可增强PLA2的活力，K＋和Ni2＋对酶活力稍有影响，而Fe2＋、Cu2＋、Zn2＋、Co2＋
706050403020100
5.0
7.0
pH值
9.0
11.0
图6反应温度（A）及pH值（B）对PLA2活力的影响Fig6.EffectoftemperatureandpHvalueonenzymat－icactivityofPLA2
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120相对酶活力（％）100806040200
Ca2＋Fe2＋Cu2＋
K＋
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其最佳反应pH值与和pH值分别约为60℃和8.5，
文献［9-10］中报道基本一致，但最适反应温度要比其高约10℃，且该酶的热稳定性也较高，这可能与其含有较多的二硫键有关。Ca2＋和Mg2＋均可增强该酶的活力，而Fe2＋、Cu2＋、K＋、Zn2＋、Ni2＋、Co2＋、Cr2＋均对该酶的活力有抑制作用。李伟国等［11］曾报道，稀土元素可影响vPLA2的活性，指出由于PLA2是一种含钙的金属酶，在其活性中心结合有1个钙离子，稀土离子可能与Ca2＋竞争性结合在PLA2的活性部位，起到调节酶活性的作用。本研究中金属离子对酶活性的抑制或促进作用可能与该机理相似，但仍需进一步研究证实。
PLA2是脂类代谢、生物膜与脂蛋白结构和功能研究中很重要的一种酶，具有特殊的药理、毒理和生
探讨其作用机化性质，因此，对PLA2进行深入研究，
制及其结构与功能之间的关系，将为其在制药领域的开发应用奠定基础。
0B
500
1000时间（min）
1500
2000
Mg2＋Zn2＋Ni2＋Co2＋Cr2＋
图7金属离子对PLA2活力的影响
Fig7.EffectofmetalionsonenzymaticactivityofPLA2
80A
706050403020100
脂肪酸释放量（μmol）参考文献
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（收稿日期：2010-09-14）
A：55℃保温；B：100℃保温图8PLA2的热稳定性曲线图Fig8.HeatstabilitycurveofPLA2
3.
讨论
关于PLA2的分离纯化，已有较多文献报道，但由于所用的蛇毒种类和纯化方法的不同，得到的实
验结果也有差异。本实验采用有机溶剂沉淀法结合SephadexG-50分子筛层析和UNDSphereS阳离子交换层析，从广东舟山眼镜蛇毒中分离纯化出一种具有较高热稳定性的PLA2。该蛋白的相对分子质量为14300，经HPLC鉴定为单一组分，回收率较高，达9％以上。其活力也较高，比活力为133μmol（／mg·min），而蛇粗毒比活力仅为73μmol／（mg·min），活力回收率超过100％。
本研究还考察了反应温度、pH值和金属离子对PLA2活力的影响，结果表明，该酶的最适反应温度