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正交法测几种因素对酶活力的影响
一、实验原理
1、酶反应受到多种因素的影响，如底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂和抑制剂等都能影响酶反应速度，并且各因素之间也相互影响（交互作用）。 1）底物浓度对酶反应速度的影响
2）酶浓度对酶反应速度的影响
3）温度对酶反应速度的影响
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最适温度不是一个固定的常数，它受底物的种类、浓度；溶液的离子强度、pH、反应时间等的影响。
4）pH对酶反应速度的影响
最适pH和最适温度一样，也不是一个固定的常数，
2、正交法
1）正交法是利用正交表来安排多因素试验、寻求最优水平组合的一种高效率试验设计方法。它从多因素试验的全部水平组合中挑选部分有代表性的水平组合进行试验，通过对这部分试验结果的分析了解全面试验的情况，找出最优水平组合。
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2）正交法的优点：用较少的试验获得较全面的数据结果，避免了在多因素、多水平试验中对每个因素的每个水平都互相搭配进行的全面试验，节省大量的人力、物力，缩短了实验时间。 3）正交表的正交性：
Ⅰ表中每一列（因素）各水平的重复数相等；
Ⅱ表中任意两列横向形成的有序数对中，所有各种可能的有序数对的重复数相同。
用正交表安排的实验，具有均衡分散的特点。即按正交表挑选出来的各因素水平组合在全部水平组合中的分布式均衡的。 4）正交实验的一般流程 Ⅰ列出试验中的因素和水平数 Ⅱ选择合适的正交表 Ⅲ根据正交表进行实验设计 Ⅳ实验并收集数据 Ⅴ分析数据，得出结论 5）结果分析
Ⅰ利用各因素同一水平试验指标之和及平均数，可比较因素不同水平对试验的影响程度。
Ⅱ计算极差，可比较不同因素的影响程度。 Ⅲ找出最佳试验条件（理论值）。
3、本实验选取四个因素，即底物浓度[S]、酶浓度[E]、温度、 pH 值，每个因素选三个水平，选择 正交表设计实验，实验设计如下表：
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表 1
因素 1 水平 1 2 3 [S]/ml 0.2 0.5 0.8 2 [E]/ml 0.2 0.5 0.8 3 温度/℃ 37 50 60 4 pH 7 8 9 4、本实验测定的是胰蛋白酶的活力，以血红蛋白为底物，血红蛋白水解后的产物多肽或氨基酸可用Folin-酚显色，在680nm下比色来得到产物浓度，从而通过一定时间内生成产物的量来判断酶反应的速度。
二、实验试剂
1、2%血红蛋白液
2、15%三氯乙酸（TCA）溶液 3、0.3mg/mL牛胰蛋白酶（1：250）
4、0.04mol/LpH为7、8、9的巴比妥钠-HCl缓冲液 5、Folin-酚试剂： Folin-A(Ⅰ): -NaOH
Folin-A(Ⅱ): -酒石酸钾（钠）
临用前将A(Ⅰ)和A(Ⅱ)按50：1体积比混合得Folin-A试剂。 Folin-B试剂：约1mol/L。
三、实验器材
温度计、试管*30、漏斗*10、移液、5mL移液管、恒温水浴锅、紫外分光光度计
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四、实验操作
按下表进行操作： 表 2
实验号 试剂/mL 1 6 8 2 4 9 3 5 7 2%血红0.2 蛋白液 缓冲溶pH7 液 酶液 2.6 0.5 0.8 0.2 0.5 0.8 0.2 0.5 0.8 pH8 1.7 pH9 1.7 pH8 2.3 pH9 2.3 pH7 1.4 pH9 2.0 pH7 2.0 pH8 2.0 37℃预温5min 0.2 0.8 0.5 50℃预温5min 0.5 0.2 0.8 60℃预温5min 0.8 0.5 0.2 37℃反应10min 50℃反应10min 50℃反应10min 反应10min后，各管均加入15%三氯乙酸溶液2mL终止反应。
另取试管一支做非酶对照，即加2%血红蛋白液0.5mL，缓冲液2.0mL，先加15%TCA2mL，摇匀放置10min后再加入酶液0.5mL。
将上述酶促和非酶对照各管反应液，室温放置15min，过滤，滤液留待Folin-酚法测定酶活力。
Folin-酚法测定酶活力：取滤液0.5mL，加入试剂A 4 mL，室温放置10min，再加试剂B0.5 mL，室温静置30min后，于680nm处测吸光度。
五、注意事项
1、应确保酶促反应的温度及反应时间的准确性。
2、为减少显色反应时间带来的误差，Folin试剂的加入顺序和最后测定吸光度的顺序应保持一致，且间隔时间应尽量相同。
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3、加入Folin-B试剂后应迅速摇匀，加一管摇一管，使还原反应产生于磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。
六、实验结果
表 3 1 [S]/ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅰ/3 Ⅱ/3 Ⅲ/3 极差 2 [E]/ml 3 温度/℃ 4 pH 试验结果 1 0.2 1 0.2 1 37 1 7 0.224 1 0.2 2 0.5 2 50 2 8 0.194 1 0.2 3 0.8 3 60 3 9 0.096 2 0.5 1 0.2 2 50 3 9 0.035 2 0.5 2 0.5 3 60 1 7 0.143 2 0.5 3 0.8 1 37 2 8 0.582 3 0.8 1 0.2 3 60 2 8 0.068 3 0.8 2 0.5 1 37 3 9 0.307 3 0.8 3 0.8 2 50 1 7 0.403 0.514 0.760 0.778 0.171 0.253 0.259 0.088 0.327 0.4 1.081 0.109 0.215 0.360 0.251 1.113 0.632 0.307 0.371 0.211 0.102 0.269 0.770 0.844 0.408 0.257 0.281 0.136 0.121 完美DOC格式整理
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以吸光度值（Ⅰ/3，Ⅱ/3，Ⅲ/3）为纵坐标，因素的水平数为横坐标作图:
0.400 吸光度 0.350 0.300 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 1 2 因素3 因素4 因素1 因素2 水平数 3 由以上实验结果分析得出结论：
1）对于因素1（底物浓度），水平三（血红蛋白0.8mL，浓度0.267mol/L）为所比较三水平中的最适条件。
2）对于因素2（酶浓度），水平三（胰蛋白酶0.8mL，浓度0.267mol/L）为所比较三水平中的最适条件。
3）对于因素3（温度），水平一（ 7℃）为所比较三水平中的最适条件。 4）对于因素4（pH），水平2（pH=8）为所比较三水平中的最适条件。 5）比较极差发现，因素3（温度）各水平的极差最大，因素1（底物浓度）各水平的极差最小，说明在本次实验考虑的各参数范围内，温度对胰蛋白酶活力的影响最大，底物浓度对胰蛋白酶活力的影响最小。
七、分析与讨论
1、经查阅资料得，胰蛋白酶的最适温度为37℃，最适pH为7.8~8.5，实验结果符合文献值。同时，对因素1和因素2的实验结果，也符合底物浓度和酶浓度对
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酶反应速率影响的理论。
2、本次实验过程中，由于操作失误，在测定1号和6号实验管的吸光度时没有将波长调至650nm，而重做1、6号产物的显色。但最终发现，第二批显色的结果与第一批结果明显不属于同一个系列。讨论后猜测原因是，第一次与第二次做显色时的条件并不完全相同，由于试管太多，第一次加Folin-A、Folin-B试剂的间隔可能没有掌握好，而第二次单独做1、6时的时间控制得较好，而此时用第一次制备的0号管作为基准显然是不合适的。我认为，在单独重做1、6号管的显色时应当重新做一个0号管作为相同条件下的比色基准才较为合理。所以这次实验虽然侥幸得出了正确的结论，但这步操作的确是不合理的。
3、正交法设计实验对实验者的细致、严谨要求很高，因为最终的每一个数据都要被用到分析中，任意数据都不能舍去。如果有某个地方做错了，就会对最后整体的结果造成影响，可谓“牵一发而动全身”，因此在实验过程中要更为细致。
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