王镜岩生物化学笔记(整理版)
大生化
第一章 蛋白质化学教学目标: 教学目标: 1.掌握蛋白质的概念,重要性和分子组成. 2.掌握α-氨基酸的结构通式和 20 种氨基酸的名称,符号,结构,分类;掌握氨基酸的重要性质;熟悉肽和活性肽的概念. 3.掌握蛋白质的一,二,三,四级结构的特点及其重要化学键. 4.了解蛋白质结构与功能间的关系. 5.熟悉蛋白质的重要性质和分类 导入:100 年前,恩格斯指出\"蛋白体是生命的存在形式\" ;今天人们如何认识蛋白质的概念和重要性? 1839 年荷兰化学家马尔德 (G.J.Mulder) 研究了乳和蛋中的清蛋白,并按瑞典化学家 Berzelius 的提议把提取的物质命名为蛋白质 (Protein, 源自希腊语,意指 \"第一重要的\" ) .德国化学家费希尔(E.Fischer)研究了蛋白质的组成和结构,在 1907 年奠立蛋白质化学.英国的鲍 林(L.Pauling)在 1951 年推引出蛋白质的螺旋; 桑格(F.Sanger)在 1953 年测出胰岛素的一级结构. 佩鲁茨(M.F.Perutz)和肯德鲁(J.C.kendrew) 在 1960 年测定血红蛋白和肌红蛋白的晶体结构.1965 年,我国生化学者首先合成了具有生物活性的蛋白质——胰岛素(insulin) . 蛋白质是由 L-α-氨基酸通过肽键缩合而成的,具有较稳定的构象和一定生物功能的生物大分子(biomacromolecule) .蛋白质是生命 活动所依赖的物质基础,是生物体中含量最丰富的大分子. 单细胞的大肠杆菌含有 3000 多种蛋白质,而人体有 10 万种以上结构和功能各异的蛋白质,人体干重的 45%是蛋白质.生命是物质 运动的高级形式,是通过蛋白质的多种功能来实现的.新陈代谢的所有的化学反应几乎都是在酶的催化下进行的,已发现的酶绝大多数是 蛋白质.生命活动所需要的许多小分子物质和离子,它们的运输由蛋白质来完成.生物的运动,生物体的防御体系离不开蛋白质.蛋白质 在遗传信息的控制,细胞膜的通透性,以及高等动物的记忆,识别机构等方面都起着重要的作用.随着蛋白质工程和蛋白质组学的兴起和 发展,人们对蛋白质的结构与功能的认识越来越深刻. 第一节 蛋白质的分子组成 一,蛋白质的元素组成 经元素分析,主要有 C(50%～55%) ,H(6%～7%) ,O(19%～24%) ,N(13%～19%) ,S(0%～4%) .有些蛋白质还含微量的 P, Fe,Cu,Zn,Mn,Co,Mo,I 等. 各种蛋白质的含氮量很接近,平均为 16%.因此,可以用定氮法来推算样品中蛋白质的大致含量. 每克样品含氮克数×6.25×100=100g 样品中蛋白质含量(g%) 二,蛋白质的基本组成单位——氨基酸 蛋白质在酸,碱或蛋白酶的作用下,最终水解为游离氨基酸(amino acid) ,即蛋
白质组成单体或构件分子.存在于自然界中的氨基酸有 300 余种,但合成蛋白质的氨基酸仅 20 种(称编码氨基酸) ,最先发现的是天门冬氨酸(1806 年) ,最后鉴定的是苏氨酸(1938 年) . (一)氨基酸的结构通式 组成蛋白质的 20 种氨基酸有共同的结构特点: 1.氨基连接在α- C 上,属于α-氨基酸(脯氨酸为α-亚氨基酸) . 2.R 是侧链,除甘氨酸外都含手性 C,有 D-型和 L-型两种立体异构体.天然蛋白质中的氨基酸都是 L-型. 注意:构型是指分子中各原子的特定空间排布,其变化要求共价键的断裂和重新形成.旋光性是异构体的光学活性,是使偏振光平面 向左或向右旋转的性质, (-)表示左旋, (+)表示右旋.构型与旋光性没有直接对应关系. (二)氨基酸的分类 1.按 R 基的化学结构分为脂肪族,芳香族,杂环,杂环亚氨基酸四类. 2.按 R 基的极性和在中性溶液的解离状态分为非极性氨基酸,极性不带电荷,极性带负电荷或带正电荷的四类. 带有非极性 R(烃基,甲硫基,吲哚环等,共 9 种) :甘(Gly) ,丙(Ala) ,缬(Val) ,亮(Leu) ,异亮(Ile) ,苯丙(Phe) ,甲硫(Met) , 脯(Pro) ,色(Trp) 带有不可解离的极性 R(羟基,巯基,酰胺基等,共 6 种) :丝(Ser) ,苏(Thr) ,天胺(Asn) ,谷胺(Gln) ,酪(Tyr) ,半(Cys) 带有可解离的极性 R 基(共 5 种) :天(Asp) ,谷(Glu) ,赖(Lys) ,精(Arg) ,组(His) ,前两个为酸性氨基酸,后三个是碱性氨基酸. 蛋白质分子中的胱氨酸是两个半胱氨酸脱氢后以二硫键结合而成,胶原蛋白中的羟脯氨酸,羟赖氨酸,凝血酶原中的羧基谷氨酸是蛋 白质加工修饰而成. (三)氨基酸的重要理化性质 1.一般物理性质 α-氨基酸为无色晶体,熔点一般在 200 oC 以上.各种氨基酸在水中的溶解度差别很大(酪氨酸不溶于水) .一般溶解于稀酸或稀碱, 但不能溶解于有机溶剂,通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出. 芳香族氨基酸(Tyr,Trp,Phe)有共轭双键,在近紫外区有光吸收能力,Tyr,Trp 的吸收峰在 280nm,Phe 在 265 nm.由于大多数 蛋白质含 Tyr,Trp 残基,所以测定蛋白质溶液 280nm 的光吸收值,是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法. 2.两性解离和等电点(isoelectric point, pI) 氨基酸在水溶液或晶体状态时以两性离子的形式存在,既可作为酸(质子供体) ,又可作为碱(质子受体)起作用,是两性电解质, 其解离度与溶液的 pH 有关. 在某一 pH 的溶液中,氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势和程度相等,成为兼性离子,呈电中性,此时溶液的 pH 称为该氨基酸的 等电点.氨基酸的 pI 是由α-羧基和α-氨基的解离常数的负对数 pK1 和 pK2 决定的.计算公式为:pI=1/2(pK1+ pK2). 若 1 个氨基酸有 3 个可解离基团,写出它们电离式后取兼性离子两边的 pK 值的平均值,即为此氨基酸的等电点(酸性氨基酸的等电 点取两羧基的 pK 值的平均值,碱性氨基酸的等电点取两氨基的 pK 值的平均值) . 3.氨基酸的化学反应 氨基酸的化学反应是其基团的特征性
反应.重要的有: (1)茚三酮反应 所有具有自由α-氨基的氨基酸与过量茚三酮共热形成蓝紫色化合物(脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质) .用分光光度法 可定量测定微量的氨基酸.蓝紫色化合物的最大吸收峰在 570nm 波长处,黄色在 440nm 波长下测定.吸收峰值的大小与氨基酸释放的氨 量成正比. (2)与 2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应 在弱碱性溶液中,氨基酸的α-氨基很容易与 DNFB 作用生成稳定的黄色 2,4-二硝基苯氨基酸(DNP-氨基酸) ,这一反应在蛋白质化 学的研究史上起过重要作用,Sanger 等人应用它测定胰岛素一级结构. 多肽顺序自动分析仪是根据相类似的原理设计的,即利用多肽链 N 端氨基酸的α-氨基与异硫氰酸苯酯 PITC 反应(Edman 降解法) . 三,肽(peptide) 1.肽键与肽链 一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸的α-氨基脱水形成的酰胺键称为肽键.由氨基酸通过肽键相连而成的化合物称为肽.肽键及其 两端的α-碳原子相连所形成的长链骨架,即…Cα—C—N—Cα—C—N—Cα—C—N—Cα…称为多肽主链,—CαCN—是重复单位.肽 键是蛋白质分子中的主要共价键.多肽链的方向性是从 N 末端指向 C 末端. 肽分子中不完整的氨基酸称为氨基酸残基.肽按其序列从 N 端到 C 端命名.一般 10 肽以下属寡肽,10 肽以上为多肽. 2.生物活性肽 (1)谷胱甘肽(glutathione,GSH) 是由 Glu,Cys,Gly 组成的一种三肽,又叫γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸(含γ-肽键) .Cys 的-SH 是主要功能基团,GSH 是一种抗氧化剂, 是某些酶的辅酶,可保护蛋白质分子中的-SH 免遭氧化,保护巯基蛋白和酶的活性.在 GSH 过氧化物酶的作用下,GSH 还原细胞内产生 的 H2O2,生成 H2O,2 分子 GSH 被氧化成 GSSG,后者在 GSH 还原酶催化下,又生成 GSH. (2)多肽类激素和神经肽 人体内有许多激素属寡肽或多肽,如下丘脑—垂体分泌的催产素(9 肽) ,加压素(9 肽) ,促肾上腺皮质激素(ACTH,39 肽)等.催产 素和加压素结构仅第 3,第 8 位两个氨基酸残基不同,前者使平滑肌收缩,有催产和使乳腺泌乳的作用;后者能使小动脉收缩,增高血压, 也有减少排尿的作用. 神经肽是在神经传导过程中起信号转导作用的肽类.如脑啡肽(5 肽) ,β-内啡肽(31 肽) ,强啡肽(17 肽)等.随着脑科学的发展, 会发现更多的生物活性肽. 第二节 蛋白质的分子结构蛋白质是生物大分子,结构比较复杂,人们用 4 个层次来描述,包括蛋白质的一级,二级,三级和四级结构.一级结构描述的是蛋白 质的线性(或一维)结构,即共价连接的氨基酸残基的序列,又称初级或化学结构.二级以上的结构称高级结构或构象(conformation) . 一,蛋白质的一级结构(primary structure) 1953 年,英国科学家 F. Sanger 首先测定了胰岛素(insulin)的一级结构,有 51 个氨基酸残基,由一条 A 链和一条 B 链组成,分子中 共有 3 个二硫键,其中两个在 A,B 链之间,另一个在 A 链内. 蛋白质的
一级结构测定或称序列分析常用的方法是 Edman 降解和重组 DNA 法.Edman 降解是经典的化学方法,比较复杂.首先要纯 化一定量的待测蛋白质,分别作分子量测定,氨基酸组成分析,N-末端分析,C-末端分析;要应用不同的化学试剂或特异的蛋白内切酶水 解将蛋白质裂解成大小不同的肽段,测出它们的序列,对照不同水解制成的两套肽段,找出重叠片段,最后推断蛋白质的完整序列.重组 DNA 法是基于分子克隆的分子生物学方法, 比较简单而高效, 不必先纯化该种蛋白质, 而是先要得到编码该种蛋白质的基因 (DNA 片段) , 测定 DNA 中核苷酸的序列,再按三个核苷酸编码一个氨基酸的原则推测蛋白质的完整序列.这两种方法可以相互印证和补充. 目前,国际互联网蛋白质数据库已有 3 千多种一级结构清楚.蛋白质一级结构是空间结构和特异生物学功能的基础. 二,蛋白质的二级结构(secondary structure) 蛋白质的二级结构是指其分子中主链原子的局部空间排列,是主链构象(不包括侧链 R 基团) . 构象是分子中原子的空间排列,但这些原子的排列取决于它们绕键的旋转,构象不同于构型,一个蛋白质的构象在不破坏共价键情况 下是可以改变的.但是蛋白质中任一氨基酸残基的实际构象自由度是非常有限的,在生理条件下,每种蛋白质似乎是呈现出称为天然构象 的单一稳定形状. 20 世纪 30 年代末,L.Panling 和 R.B.Corey 应用 X 射线衍射分析测定了一些氨基酸和寡肽的晶体结构,获得了一组标准键长和键角, 提出了肽单元(peptide unit)的概念, 还提出了两种主链原子的局部空间排列的分子模型(α-螺旋)和(β-折叠) . 1.肽单位 肽键及其两端的α-C 共 6 个原子处于同一平面上,组成了肽单位(所在的平面称肽键平面) . 肽键 C—N 键长为 0.132nm,比相邻的单键(0.147nm)短,而较 C=N 双键(0.128nm)长,有部分双键的性质,不能自由旋转.肽键 平面上各原子呈顺反异构关系,肽键平面上的 O,H 以及 2 个α-碳原子为反式构型(trans configuration) . 主链中的 Cα—C 和 Cα—N 单键可以旋转,其旋转角φ,ψ决定了两个相邻的肽键平面相对关系.由于肽键平面的相对旋转,使主 链可以以非常多的构象出现.事实上,肽链在构象上受到很大,因为主链上有 1/3 不能自由旋转的肽键,另外主链上有很多侧链 R 的 影响.蛋白质的主链骨架由许多肽键平面连接而成. 2.α-螺旋(α-helix) α-螺旋是肽键平面通过α-碳原子的相对旋转形成的一种紧密螺旋盘绕,是有周期的一种主链构象.其特点是: ① 螺旋每转一圈上升 3.6 个氨基酸残基,螺距约 0.54nm(每个残基上升 0.15nm,旋转 100O) . ② 相邻的螺圈之间形成链内氢键,氢键的取向几乎与中心轴平行.典型α-螺旋一对氢键 O 与 N 之间共有 13 个原子(3.613) ,前后间隔 3 个残基. ③螺旋的走向绝大部分是右手螺旋,残基侧链伸向外侧.R 基团的大小,荷电状态及形状均对α-螺旋的形成及稳定有影响.
3.β-折叠(β-pleated sheet) β-折叠是一种肽链相当伸展的周期性结构. ① ② ③ 相邻肽键平面间折叠成 110O 角,呈锯齿状. 两个以上具β-折叠的肽链或同一肽链内不同肽段相互平行排列,形成β-折叠片层,其稳定因素是肽链间的氢键. 逆向平行的片层结构比顺向平行的稳定. α-螺旋和β-折叠是蛋白质二级结构的主要形式.毛发中的α-角蛋白和蚕丝中的丝心蛋白是其典型,在许多球蛋白中也存在,但所占 比例不一样. 胶原蛋白中存在的螺旋结构不同于一般的α-螺旋, 是由 3 条具有左手螺旋的链相互缠绕形成右手超螺旋分子. 链间氢键以及螺旋和超 螺旋的反向盘绕维持其稳定性. 4.β-转角(β-turn) 为了紧紧折叠成球蛋白的紧密形状,多肽链 180O 回折成发夹或β-转角.其处由 4 个连续的氨基酸残基构成,常有 Gly 和 Pro 存在, 稳定β-转角的作用力是第一个氨基酸残基羰基氧(O)与第四个氨基酸残基的氨基氢(H)之间形成的氢键.β-转角常见于连接反平行β -折叠片的端头. 5.无规卷曲(random coil) 多肽链的主链呈现无确定规律的卷曲.典型球蛋白大约一半多肽链是这样的构象. 6.超二级结构和结构域 超二级结构和结构域是蛋白质二级至三级结构层次的一种过渡态构象. 超二级结构指蛋白质中两个或三个具有二级结构的肽段在空间上相互接近,形成一特殊的组合体,又称为模体(motif) .通常有αα, ββ,βαβ等,例如钙结合蛋白质中的螺旋-环-螺旋模序及锌指结构. 结构域是球状蛋白质的折叠单位,是在超二级结构基础上进一步绕曲折叠有独特构象和部分生物学功能的结构.对于较小的蛋白质分 子或亚基,结构域和三级结构是一个意思,即这些蛋白质是单结构域的;对于较大的蛋白质分子或亚基,多肽链往往由两个或两个以上的 相对的结构域缔合成三级结构. 三,蛋白质的三级结构(tertiary structure) 指一条多肽链中所有原子的整体排布,包括主链和侧链.维系三级结构的作用力主要是次级键(疏水相互作用,静电力,氢键等) . 在序列中相隔较远的氨基酸疏水侧链相互靠近,形成\"洞穴\"或\"口袋\"状结构,结合蛋白质的辅基往往镶嵌其内,形成功能活性部位, 而亲水基团则在外,这也是球状蛋白质易溶于水的原因.1963 年 Kendrew 等从鲸肌红蛋白的 X 射线衍射图谱测定它的三级结构(153 个 氨基酸残基和一个血红素辅基,相对分子质量为 17800) .由 A→H 8 段α-螺旋盘绕折叠成球状,氨基酸残基上的疏水侧链大都在分子内部 形成一个袋形空穴,血红素居于其中,富有极性及电荷的则在分子表面形成亲水的球状蛋白. 四,蛋白质的四级结构 (quaternary structure) 有些蛋白质的分子量很大,由 2 条或 2 条以上具有三级结构的多肽链通过非共价键相互结合而成,称为蛋白质的四级结构.构成 四级结构的每条多肽链称为亚基 (subunit),亚基单独存在时一般没有生物学功能,构成四级结构的几个亚基可以相同或不同.如血红蛋白
(hemoglobin,Hb) 是由两个α-亚基和两个β-亚基形成的四聚体(α2β2) . 五,蛋白质分子中的化学键 蛋白质的一级结构是由共价键形成的,如肽键和二硫键.而维持空间构象稳定的是非共价的次级键.如氢键,盐键,疏水键,范德华 引力等. 第三节 蛋白质结构与功能的关系一,蛋白质一级结构与功能的关系 (一)一级结构是空间构象的基础 20 世纪 60 年代初,美国科学家 C.Anfinsen 进行牛胰核糖核酸酶的变性和复性实验,提出了蛋白质一级结构决定空间结构的命题. 核糖核酸酶由 124 个氨基酸残基组成, 4 对二硫键. 有 用尿素和β-巯基乙醇处理该酶溶液, 分别破坏次级键和二硫键, 肽链完全伸展, 变性的酶失去催化活性;当用透析方法去除变性剂后,酶活性几乎完全恢复,理化性质也与天然的酶一样. 概率计算表明,8 个半胱氨酸残基结合成 4 对二硫键,可随机组合成 105 种配对方式,而事实上只形成了天然酶的构象,这说明一级 结构未破坏,保持了氨基酸的排列顺序就可能回复到原来的三级结构,功能依然存在. (二)种属差异 大量实验结果证明,一级结构相似的多肽或蛋白质,其空间结构和功能也相似,不同种属的同源蛋白质有同源序列,反映其共同进化 起源,通过比较可以揭示进化关系. 例如哺乳动物的胰岛素,其一级结构仅个别氨基酸差异(A 链 5,6,10 位,B 链 30 位) ,它们对生物活性调节糖代谢的生理功能不 起决定作用. 从各种生物的细胞色素 C(cytochrome c ) 的一级结构分析,可以了解物种进化间的关系.进化中越接近的生物,它们的细胞色素 c 的 一级结构越近似. (三)分子病 分子病是指机体 DNA 分子上基因缺陷引起 mRNA 分子异常和蛋白质生物合成的异常, 进而导致机体某些功能和结构随之变异的遗传 病.在 1904 年,发现镰刀状红细胞贫血病.大约化费了 40 多年才清楚患病原因,患者的血红蛋白(HbS)与正常人的(HbA)相比,仅 β-链的第 6 位上,Val 取代了正常的 Glu.目前全世界已发现有异常血红蛋白 400 种以上. 二,蛋白质空间结构与功能的关系 蛋白质的空间结构是其生物活性的基础,空间结构变化,其功能也随之改变.肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)是典型的例子. 肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)都能与氧进行可逆的结合,氧结合在血红素辅基上.然而 Hb 是四聚体分子,可以转运氧;Mb 是 单体,可以储存氧,并且可以使氧在肌肉内很容易地扩散.它们的氧合曲线不同,Mb 为一条双曲线,Hb 是一条 S 型曲线.在低 p(O2) 下,肌红蛋白比血红蛋白对氧亲和性高很多,p(O2)为 2.8torr(1torr≈133.3Pa)时,肌红蛋白处于半饱和状态.在高 p(O2)下,如在肺部(大 约 100torr)时,两者几乎都被饱和.其差异形成一个有效的将氧从肺转运到肌肉的氧转运系统. Hb 未与氧结合时,其亚基处于一种空间结构紧密的构象(紧张态,T 型) ,与氧的亲和力小.只要有一个亚基与氧结合,就能使 4 个 亚基间的盐键断裂,变成松弛的构象(松弛态,R 型)
型和 R 型的相互转换对调节 Hb 运氧的功能有重要作用.一个亚基与其配体结合 .T 后能促进另一亚基与配体的结合是正协同效应,其理论解释是 Hb 是别构蛋白,有别构效应. 第四节 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质和氨基酸相似,有两性解离及等电点,紫外吸收和呈色反应.作为生物大分子,还有胶体性质,沉淀,变性和凝固 等特点.要了解和分析蛋白质结构和功能的关系就要利用其特殊的理化性质,采取盐析,透析,电泳,层析及离心等不损伤蛋白质空间构 象的物理方法分离纯化蛋白质. 一,蛋白质的高分子性质 蛋白质的相对分子质量在 1 万~100 万,其颗粒平均直径约为 4.3 nm(胶粒范围是 1~100nm) .准确可靠的测定方法是超离心法,蛋白 质的相对分子质量可用沉降系数(S)表示. 在球状蛋白质三级结构形成时,亲水基团位于分子表面,在水溶液中与水起水合作用,因此,蛋白质的水溶液具有亲水胶体的性质. 颗粒表面的水化膜和电荷是其稳定的因素,调节 pH 至 pI,加入脱水剂等,蛋白质即可从溶液中沉淀出来. 透析法是利用蛋白质不能透过半透膜的性质,去掉小分子物质,达到纯化的目的. 大小不同的蛋白质分子可以通过凝胶过滤分开.又称分子筛层析. 二,蛋白质的两性解离 蛋白质和氨基酸一样是两性电解质,在溶液中的荷电状态受 pH 值影响.当蛋白质溶液处于某一 pH 时,蛋白质解离成正,负离子的 趋势相等,即成为兼性离子,净电荷为零,此时溶液的 pH 称为该蛋白质的等电点.pH>pI 时,该蛋白质颗粒带负电荷,反之则带正电荷. 在人体体液中多数蛋白质的等电点接近 pH5,所以在生理 pH7.4 环境下,多数蛋白质解离成阴离子.少量蛋白质,如鱼精蛋白,组蛋白的 pI 偏于碱性,称碱性蛋白质,而胃蛋白酶和丝蛋白为酸性蛋白. 三,蛋白质的变性,沉淀和凝固 蛋白质在某些理化因素的作用下,空间结构被破坏,导致理化性质改变,生物学活性丧失,称为蛋白质的变性(denaturation) . 蛋白质变性的本质是多肽链从卷曲到伸展的过程,不涉及一级结构的改变(如加热破坏氢键,酸碱破坏盐键等) .变性作用不过于剧 烈,是一种可逆反应,去除变性因素,有些蛋白质原有的构象和功能可恢复或部分恢复,称为复性(denaturation) . 蛋白质变性的主要表现是失去生物学活性,如酶失去催化能力,血红蛋白失去运输氧的功能,胰岛素失去调节血糖的生理功能等.变 性蛋白溶解度降低,易形成沉淀析出;易被蛋白水解酶消化.蛋白质变性具有重要的实际意义. 蛋白质自溶液中析出的现象,称为蛋白质的沉淀.盐析,有机溶剂,重金属盐,生物碱试剂都可沉淀蛋白质.盐析沉淀蛋白质不变性, 是分离制备蛋白质的常用方法.如血浆中的清蛋白在饱和的硫酸铵溶液中可沉淀,而球蛋白则在半饱和硫酸铵溶液中发生沉淀.乙醇,丙 酮均为脱水剂,可破坏水化膜,降低水的介电常数,使蛋白质的解离程度降低,表面电荷减少,从而使蛋白质沉淀析出.低温时,用丙酮 沉淀蛋白质,可保留原有的生物学活性.但
用乙醇,时间较长则会导致变性.重金属盐(Hg2+,Cu2+,Ag+) ,生物碱(如三彔乙酸,苦 味酸,鞣酸)与蛋白质结合成盐而沉淀,是不可逆的. 蛋白质变性不一定沉淀(如强酸,强碱作用变性后仍然能溶解于强酸,强碱溶液中,将 pH 调至等电点,出现絮状物,仍可溶解于强 酸,强碱溶液,加热则变成凝块,不再溶解) .凝固是蛋白质变性发展的不可逆的结果.沉淀的蛋白质不一定变性(如盐析) . 四,蛋白质的紫外吸收和呈色反应 蛋白质含芳香族氨基酸,在 280nm 波长处有特征性吸收峰,用于定量测定. 蛋白质分子中的多种化学基团具有特定的化学性能,与某些试剂产生颜色反应,可用于定性,定量分析.如蛋白质分子中含有许多和 双缩脲结构相似的肽键,在碱性溶液与硫酸铜反应产生红紫色络合物(双缩脲反应) .酪氨酸含酚基,与米伦试剂生成白色沉淀,加热后 变红色.Folin-酚试剂与酪氨酸反应生成蓝色.色氨酸与乙醛酸反应,慢慢注入浓硫酸,出现紫色环. 第五节 蛋白质的分类自然界蛋白质分布广泛,种类繁多,有 1012~1013 种.目前仍无法按蛋白质的化学结构进行精确的分类,一般按蛋白质的分子形状, 分子组成,生物功能进行分类. 1.按分子形状分为球状蛋白质和纤维状蛋白质. 2.按分子组成分为简单蛋白质和结合蛋白质. 简单蛋白质完全水解的产物仅为α-氨基酸.这类蛋白质按其溶解度等理化性质分为 7 类.包括清蛋白,球蛋白,醇溶蛋白,谷蛋白,精蛋 白,组蛋白和硬蛋白. 结合蛋白质由简单蛋白质和非蛋白质(辅基)组成.根据辅基的不同,这类蛋白质可分为 5 类.如核蛋白,糖蛋白,脂蛋白,色蛋白 和磷蛋白. 细胞核中的核蛋白是 DNA 与组蛋白结合而成,细胞质中的核糖体是 RNA 与蛋白质组成的,已知的病毒也是核蛋白.免疫球蛋白是一 类糖蛋白,由蛋白质与糖以共价键相连而成;脂蛋白由蛋白质与脂类通过非共价键相连,存在生物膜和动物血浆中. 3.按蛋白质功能分为活性蛋白质和非活性蛋白质. 活性蛋白质包括有催化功能的酶,有调节功能的激素,有运动,防御,接受和传递信息的蛋白质以及毒蛋白,膜蛋白等.胶原,角蛋 白,弹性蛋白,丝心蛋白等是非活性蛋白质. 第二章 核酸的化学教学目标: 学目标: 1.掌握 DNA 和 RNA 在化学组分,分子结构和生物功能上的特点. 2.掌握 DNA 双螺旋结构模型和 t-RNA 二级结构的要点,了解核酸的三级结构. 3.熟悉核酸的性质(一般性质,DNA 热变性,复性与分子杂交) . 4.掌握基因组的概念,原核生物和真核生物基因组的特点.了解 DNA 测序的原理. 导入:核酸是生物遗传的物质基础.它的发现和研究进展如何? 1868 年瑞士青年医生 Miescher 从脓细胞核中分离出一种含磷量很高的酸性化合物,称为核素.其继任者 Altman 发展了从酵母和动物 组织中制备不含蛋白质的核酸的方法,于 18 年提出核酸(nucleic acid)这一名称.早期核酸研究因\"四核苷酸假说\"的错误进展缓慢. 1943 年 Chargaff 等揭示了 DNA 的碱基配对规律,1944 年美国
Avery 利用致病肺炎球菌中提取的 DNA 使另一种非致病性的肺炎球菌 的遗传性状发生改变而成为致病菌,发现正是 DNA 携带遗传信息.Astbury,Franklin 和 Wilkins 用 X 射线衍射法研究 DNA 分子结构,得 到清晰衍射图.Watson 和 Crick 在此基础上于 1953 年提出了 DNA 双螺旋结构模型,说明了基因结构,信息和功能三者之间的关系,奠 定了分子生物学基础.1958 年 Crick 提出\"中心法则\" ;60 年代破译遗传密码,阐明 3 类 RNA 参与蛋白质生物合成的过程;70 年代诞生 了基因重组和 DNA 测序生物技术,90 年代提出人类基因组计划,21 世纪进入后基因组时代.核酸的研究成了生命科学中最活跃的领域之 一. 第一节 核酸的化学组成 天然存在的核酸有两类,即脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)和核糖核酸(ribonucleic acid,RNA) .DNA 分子是生物体 的遗传信息库,分布在原核细胞的核区,真核细胞的核和细胞器以及病毒中;RNA 分子参与遗传信息表达的一些过程,主要存在于细胞 质. 一,核酸的基本组成单位 核酸是一种多聚核苷酸,用不同的降解法得到其组成单位——核苷酸.而核苷酸又由碱基,戊糖和磷酸组成. (一) 戊糖 DNA 含β-D-2-脱氧核糖,RNA 含β-D-核糖.这是核酸分类的依据.核糖中的 C 记为 1'……5' . (二)碱基(base) 核酸中的碱基有两类:嘌呤碱和嘧啶碱.有 5 种基本的碱基外,还有一些含量甚少的稀有碱基.DNA 和 RNA 中常见的两种嘌呤碱是 腺嘌呤(adenine,A) ,鸟嘌呤(guanine,G) .而嘧啶碱有所不同:RNA 主要含胞嘧啶(cytosine,C) ,尿嘧啶(uracil,U) ,DNA 主要 含胞嘧啶,胸腺嘧啶(thymine,T) . tRNA 中含有较多的稀有碱基(修饰碱基) ,多为甲基化的. (三)核苷 是碱基和戊糖生成的糖苷.通过 C1'(四)核苷酸 是核苷的磷酸酯.生物体内游离存在的多是 5'核苷酸(如 pA,pdG 等) .常见的核苷酸为 AMP,GMA,CMP,UMP.常见 的脱氧核苷酸有 dAMP, dGMA, dCMP, dTMP. AMP 是一些重要辅酶的结构成分 (如 NAD+, NADP+, FAD 等) 环化核苷酸 ; (cAMP/cGMP) 是细胞功能的调节分子和信号分子.ATP 在能量代谢中起重要作用. 核苷酸是两性电解质,有等电点.核苷酸有互变异构和紫外吸收. (含氧的碱基有酮式和烯醇式两种互变异构体,在生理 pH 条件下主 要以酮式存在) 二,核苷酸的连接方式 RNA 和 DNA 链都有方向性,从 5'→ 3' .前一位核苷酸的 3'- OH 与下一位核苷酸的 5'位磷酸基之间形成 3' ,5'-磷酸二酯键, 从而形成一个没有分支的线性大分子,两个末端分别称为 5'末端和 3'末端.大分子的主链由相间排列的戊糖和磷酸构成,而碱基可看 作主链上的侧链基团,主链上的磷酸基是酸性的,在细胞 pH 下带负电荷;而碱基有疏水性. 讨论:列表说明 DNA 和 RNA 在化学组成,分子结构和生物功能方面的主要特点. N9 或 C1'- N1 糖苷键连接,用单字符表示,脱氧核苷则在单字符前加 d.常见的修饰核苷 有:次黄苷或肌苷为 I,黄嘌呤核
苷 X,二氢尿嘧啶核苷 D,假尿苷Ψ等.注意符号的意义,如 m5dC. 第二节一, DNA 的分子结构 DNA 的一级结构 (primary stucture) 磷酸端作 为多核苷酸链的\"头\" ,写在左侧,如 pACUGA( 3' . ) DNA 的一级结构是指分子中脱氧核苷酸的排列顺序,常被简单认为是碱基序列(base sequence) .碱基序有严格的方向性和多样性. 一般将 5'5'→ 在 DNA 一级结构中,有一种回文结构的特殊序列,所谓回文结构即 DNA 互补链上一段反向重复顺序,正读和反读意义相同,经反折 可形成\"十字形\"结构,在转录成 RNA 后可形成\"发夹\"样结构,有意义. → GCTA GTTCA CTC TGAAC AATT → ← CGAT CAAGT GAG ACTTG TTAA ← DNA 分子很大,最小的病毒 DNA 约含 5000b.1965 年 Holley 用片段重叠法完成酵母 tRNAala 76nt 序列测定;1977 年 Sanger 利用双 脱氧法(酶法)测定了φX174 单链 DNA5386b 的全序列.1990 年实施的人类基因组计划(HGP) ,用 15 年,投资 30 亿美元,完成人类 单倍体基因组 DNA3×109bp 全序列的测定.该计划由美,英,日,法,德,中六国科学家合作,于 2003 年提前完成,生命科学进入后基 因组时代,研究重点从测序转向对基因组功能的研究. 二,DNA 的二级结构——双螺旋(double helix) 1953 年, Watson 和 Crick 根据 Wilkins 和 Franklin 拍摄的 DNA X-射线照片 (DNA 有 0.34nm 和 3.4nm 两个周期性变化) 以及 Chargaff 等人对 DNA 的碱基组成的分析(A=T,G=C,A+G=C+T) ,推测出 DNA 是由两条相互缠绕的链形成.Watson-Crick 双螺旋结构模型如下 图: 1.两条反向平行的多核苷酸链形成右手螺旋.一条链为 5'→ 3' ,另一条为 3'→ 5'(某些病毒的 DNA 是单链分子 ssDNA) . 2.碱基在双螺旋内侧,A 与 T,G 与 C 配对,A 与 T 形成两个氢键,G 与 C 形成三个氢键.糖基-磷酸基骨架在外侧.表面有一条大 沟和一小沟. 3.螺距为 3.4 nm,含 10 个碱基对(bp) ,相邻碱基对平面间的距离为 0.34 nm.螺旋直径为 2 nm. 氢键维持双螺旋的横向稳定.碱基对平面几乎垂直螺旋轴,碱基对平面间的疏水堆积力维持螺旋的纵向稳定. 4.碱基在一条链上的排列顺序不受.遗传信息由碱基序所携带. 5.DNA 构象有多态性. Watson 和 Crick 根据 Wilkins 和 Franklin 拍摄的 DNA X-射线照片是相对湿度 92%的 DNA 钠盐所得的衍射图,因此 Watson-Crick 双 螺旋结构称 B-DNA.细胞内的 DNA 与它非常相似.另外还有 A-DNA,C-DNA,D-DNA. 1979 年 Rich 发现 Z-DNA(左手螺旋,螺距 4.5nm,直径 1.8nm) 三,DNA 的三级结构 DNA 双螺旋进一步盘曲所形成的空间构象称 DNA 的三级结构. 某些病毒,细菌,真核生物线粒体和叶绿体的 DNA 是环形双螺旋,再次螺旋化形成超螺旋;在真核生物细胞核内的 DNA 是很长的线 形双螺旋,通过组装形成非常致密的超级结构. 1.环形 DNA 可形成超螺旋 当将线性过旋或欠旋的双螺旋 DNA 连接形成一个环时,都会自动形成额外的
超螺旋来抵消过旋或欠旋造成的应力,目的是维持 B 构 象.过旋 DNA 会自动形成额外的左手螺旋(正超螺旋) ,而欠旋形成额外的右手螺旋(负超螺旋) . 一段双螺旋圈数为 10 的 B-DNA 连接成环形时,不发生进一步扭曲,称松弛环形 DNA(双螺旋的圈数=链绕数,即 T=L,超螺旋数 W=0;L=T+W) ,但将这一线形 DNA 的螺旋先拧松一圈再连接成环时,解链环形 DNA 存在的扭曲张力,可导致双链环向右手方向扭曲形 成负超螺旋(T=10,L=9,W = -1) . 在生物体内,绝大多数超螺旋 DNA 以负超螺旋的形式存在,也就是说,一旦超螺旋解开,则会形成解链环形 DNA,有利于 DNA 复 制或转录. 螺旋具有相同的结构,但 L 值不同的分子称为拓扑异构体.DNA 拓扑异构酶切断一条链或两条链,拓扑异构体可以相互转变.W 的 正表示双链闭环的螺旋圈在增加,W 的负表示减少.L 和 T 的正负表示螺旋方向,右手为正,左手螺旋为负;L 值必定是整数. 2.真核细胞染色体 真核细胞 DNA 是线形分子,与组蛋白结合,其两端固定也形成超螺旋结构.DNA 被紧密地包装成染色体来自三个水平的折叠:核小 体,30nm 纤丝和放射环. 核小体是染色体的基本结构单位,是 DNA 包装的第一步,它由 DNA 结合到组蛋白上形成复合物,在电镜下显示为成串的\"念珠\"状. 组蛋白是富含精氨酸和赖氨酸的碱性蛋白质,其氨基酸序列在进化中是高度保守的.组蛋白有 5 种,H2A,H2B,H3 和 H4 各两分子组成 的八聚体是核小体核心颗粒,DNA 缠绕其上,相邻核小体间的 DNA 称为连接 DNA 且结合 H1.200 bpDNA 的长度约为 68nm,被压缩在 10nm 的核小体中.压缩比约为 7.30nm 纤丝是第二级压缩,每圈含 6 个核小体,压缩比是 6.30nm 螺旋管再缠绕成超螺旋圆筒,压缩比 是 40.再进一步形成染色单体,总压缩近一万倍.典型人体细胞的 DNA 理论长度应是 180 cm,被包装在 46 个 5μm 的染色体中. 四,DNA 和基因组 1.DNA 分子中的最小功能单位称作基因,为 RNA 或蛋白质编码的基因称结构基因,DNA 中具调节功能而不转录生成 RNA 的片段 称调节基因.基因组(genome)是某生物体所含的全部基因,即全部 DNA 或完整的单套遗传物质(配子中的整套基因) . 2.细菌,噬菌体,大多数动植物病毒的基因组即指单个 DNA 分子.最小病毒如 SV40 的基因组仅有 5226b,含 5 个基因.大肠杆菌 含 4.6×106 bp,有 3000~4000 个基因,DNA 完全伸展总长约 1.3mm. 原核生物基因组的特点是:结构简炼,绝大部分为蛋白质编码(结构基因) ;有转录单元,即功能相关的基因常串联一起,并转录在 同一 mRNA(多顺反子 mRNA)中;有基因重叠现象,即同一段 DNA 携带两种不同蛋白质的信息. 3.真核生物基因一般分布在若干条染色体上,其特点是:有重复序列(按重复次数分单拷贝序,中度重复序和高度重复序) ;有断裂 基因(由不编码的内含子和编码的外显子组成) .酵母基因组有 1.35×107bp,含 6374 个基因.人类基因组有 3×109 bp,含 4 万个基因. 第三节
RNA 的分子结构 RNA 通常以单链形式存在,比 DNA 分子小得多,由数十个至数千个核苷酸组成.RNA 链可以回折且通过 A 与 U,G 与 C 配对形成 局部的双螺旋,不能配对的碱基则形成环状突起,这种短的双螺旋区和环称为发夹结构. RNA 的 C2'位羟基是游离的,是一个易发生不良反应的位置,它使 RNA 的化学性质不如 DNA 稳定,能较 DNA 产生更多的修饰组 分.RNA 的种类,大小,结构都比 DNA 多样化,按照功能的不同和结构的特点,RNA 主要分为 tRNA,rRNA 和 mRNA 三类.此外,细 胞的不同部位还存在着另一些小分子 RNA,如核内小 RNA(snRNA) ,核仁小 RNA(snoRNA) ,胞质小 RNA(scRNA)等,分别参与 mRNA 的前体(hnRNA)和 rRNA 的转运和加工过程. 一,转运 RNA(transfer RNA,tRNA) 1.分子量最小的 RNA,约占总 RNA 的 15%.主要功能是在蛋白质生物合成过程中,起着转运氨基酸的作用. 2.1965 年 Holley 等测定了酵母丙氨酸 tRNA 的一级结构,并提出二级结构模型.一级结构特点:核苷酸残基数在 73~95;含有较多 的稀有碱基(如 mG,DHU 等) ;5'-末端多为 pG,3'- 末端都是-CCA. 3.tRNA 的二级结构为\"三叶草\"形,包括 4 个螺旋区,3 个环及一个附加叉.各部分的结构都和它的功能有关.5'端 1~7 位与近 3' 端 67~72 位形成的双螺旋区称氨基酸臂,似\"叶柄\" ,3'端有共同的-CCA-OH 结构,用于连接该 RNA 转运的氨基酸.3 个环是二氢尿嘧 啶环(D 环) ,反密码子环,TΨC 环. 4.1973~1975 年 S.H.Kim 的 X 射线衍射分析表明,tRNA 的三级结构呈倒 L 字母形,反密码环和氨基酸臂分别位于倒 L 的两端. 二,信使 RNA(messenger RNA,m RNA) 1.细胞内含量较少的一类 RNA,约占总 RNA 的 3%.其功能是将核内 DNA 的碱基顺序(遗传信息)按碱基互补原则转录至核糖体, 指导蛋白质的合成. 2.种类多,作为不同蛋白质合成的模板,其一级结构差异很大.真核细胞的 mRNA 有不同于原核细胞的特点:3'(polyA)尾,5'-末端加有一个\"帽\"式结构,(m7 Gppp) . 3.代谢活跃,寿命较短. 三,核糖体 RNA(ribosomal RNA,rRNA) 1.约占细胞总 RNA 的 80%.主要功能是与多种蛋白质组成核糖体,是蛋白质合成的场所. 2.核糖体在结构上可分离为大小两个亚基.原核细胞的 rRNA 有 3 种,23S 与 5S rRNA 在大亚基,16S 在小亚基.真核细胞有 4 种 rRNA,其中大亚基含 28S,5.8S,5S,小亚基只有 18S. 3. 各种 rRNA 的一级结构中的核苷酸残基数及其顺序都不相同,且有特定的二级结构. 末端有多聚 A 第四节 核酸的性质一,一般理化性质 1.DNA 为白色纤维状固体,RNA 为白色粉末;都微溶于水,不溶于一般有机溶剂.常用乙醇从溶液中沉淀核酸. 2.具有大分子的一般特性.分子大小可用 Da,b 或 bp,S,链长(μm)表示.一个 bp 相当的核苷酸平均分子量为 660Da;1μm 长 的 DNA 双螺旋相当 3000bp 或 2×106Da. 3.两性电解质.各种核酸的大小及所带的电荷不同,可用电泳和离子交换法分
离.RNA 在室温下易被稀碱水解,DNA 较稳定,此特 性用来测定 RNA 的碱基组成和纯化 DNA. 4.紫外吸收,最大吸收峰在 260nm 处,核酸的变性或降解,吸光度 A 升高,称为增色效应. 二,核酸的变性和复性 1.变性的概念 在理化因素作用下,核酸的双螺旋区氢键断裂,空间结构破坏,形成单链无规线团状态的过程.变性的因素有热,酸,碱,乙醇,尿 素等.变性的本质是次级键的变化.变性的结果是紫外吸收值明显增加(增色效应) ,DNA 粘度下降,生物学功能部分或全部丧失. 2.DNA 的热变性和 Tm DNA 热变性过程中,紫外吸收值增高,有一个特征性曲线称熔解曲线,通常将熔解曲线的中点,即紫外吸收值达到最大值 50%时的 温度称为解链温度,又叫熔点(Tm) .DNA 的热变性是爆发式的,像结晶的溶解一样,只在很狭窄的温度范围内完成,一般在 70~800C 之间.变性温度与碱基组成,DNA 长度及变性条件有关.GC 含量越高,Tm 越大;DNA 越长,Tm 越大;溶液离子强度增高,Tm 增加. 3.DNA 的复性与分子杂交 变性 DNA 在适当条件下, 两条互补链可重新配对, 恢复天然双螺旋构象, 这一现象称为复性. 热变性的 DNA 经缓慢冷却后即可复性, 这一过程称为退火(annealing) . 影响复性速度的因素很多,如单链 DNA 的起始浓度,温度(最适复性温度是比 Tm 约低 250C) ,盐浓度,片断长度,序列复杂性等. 分子杂交是以核酸的变性和复性为基础,只要不同来源的核酸分子的核苷酸序列含有可以形成碱基互补配对的片段,就可以形成 DNA/DNA,RNA/RNA 或 DNA/RNA 杂化双链,这个现象称为核酸分子杂交(hybridization) . 标记一个来源的核酸(放射性同位素或荧光标记) ,通过杂交可以检测与其有互补关系的 DNA 或 RNA,这种标记的核酸称为基因探 针(gene probe) ,也就是一段带有检测标记,且顺序已知,与目的基因互补的核酸序列.基因探针的\"集成化\" 就是基因芯片(gene chip) . 是把已经测序的基因固定在硅片或玻璃片上制成的.在医疗诊断和科学研究中已被快速地运用. 三,核酸的序列测定 DNA 序列是指携带遗传信息的 DNA 分子中的 A,C,G,T 的序列.分析方法主要有两种,一种是 Maxam-Gilbert 化学法,另一种是 Sanger 的双脱氧法.现在一般都采用后者,其基本原理是: 1.用凝胶电泳分离待测的 DNA 片段(用作模板) . 2.将模板,引物,4 种 dNTP,合适的聚合酶置于 4 个试管,每一试管按精确比例各加入一种 ddNTP,用同位素或荧光物质标记. 3.利用 ddNTP 可特异地终止 DNA 链延长的特点,4 个试管的聚合反应可以得到一系列大小不等,被标记的片段. 4.将 4 个反应管同时加到聚丙烯凝胶上电泳,标记片段按大小分离,放射自显影后可按谱型读出 DNA 序列. 在以上两种方法的基础上,通过与计算机技术和荧光技术的结合,发明了自动测序仪.目前,常用的测序策略是\"鸟法\" ,形象地 说是将较长的基因片段打断,构建一系列的随机亚克隆,然后测定每个亚克隆的序列,用计算机分析以发
现重叠区域,最终对大片段的 DNA 定序. 第三章 酶教学目标: 教学目标: 1.掌握酶的概念和作用特点,了解酶的分类与命名. 2.熟悉酶的分子组成,结构与功能(单纯酶和结合酶,酶的辅因子,维生素的类别与功能,酶的活性部位,酶原激活,同工酶,变 构酶和抗体酶) . 3.熟悉酶的作用机制. 4.熟悉影响酶促反应的因素(酶浓度,底物浓度,温度,pH,激活剂与抑制剂;掌握酶促反应速度的表示,米氏方程和米氏常数的 意义) . 5.了解酶的制备与应用. 第一节 概 论导入:酶学知识来源于生产与生活实践.我们祖先很早就会制酱和酿酒.西方国家于 1810 年发现酵母可将糖转化为酒精;1833 年, Payen 及 Persoz 从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀得到一种热不稳定物,可使淀粉水解成可溶性糖;1878 年德国科学家屈内(Kuhne)首先 把这类物质称为酶(enzyme,其意\"在酵母中\" ) .1860 年法国科学家巴斯德(Pasteur)认为发酵是酵母细胞生命活动的结果,细胞破裂 则失去发酵作用.17 年,Buchner 兄弟首次用不含细胞的酵母提取液实现了发酵,证明发酵是酶作用的化学本质,获得 1911 年诺贝尔 化学奖.1926 年,美国生化学家 Sumner 第一次从刀豆得到脲酶结晶,并证明是蛋白质.1930 年,Northrop 得到胃蛋白酶的结晶(1946 年二人共获诺贝尔化学奖) .1963 年测定第一个牛胰 RNaseA 序列(124aa) ;1965 年揭示卵清溶菌酶的三维结构(129aa) . 一,酶的概念 酶是由活细胞合成的, 对其特异底物起高效催化作用的生物催化剂 (biocatalyst) 已发现的有两类: . 主要的一类是蛋白质酶 (enzyme) , 生物体内已发现 4000 多种,数百种酶得到结晶.美国科学家 Cech 于 1981 年在研究原生动物四膜虫的 RNA 前体加工成熟时发现核酶 \"ribozyme\" ,为数不多,主要做用于核酸(19 年的诺贝尔化学奖) . 二,酶的作用特点 酶所催化的反应称为酶促反应.在酶促反应中被催化的物质称为底物,反应的生成物称为产物.酶所具有的催化能力称为酶活性. 酶作为生物催化剂,具有一般催化剂的共性,如在反应前后酶的质和量不变;只催化热力学允许的化学反应,即自由能由高向低转变 的化学反应;不改变反应的平衡点.但是,酶是生物大分子,又具有与一般催化剂不同的特点. 1.极高的催化效率 酶的催化效率通常比非催化反应高 108～1020 倍,比一般催化剂高 107～1013 倍.例如,脲酶催化尿素的水解速度是 H+催化作用的 7 ×1012 倍;碳酸酐酶每一酶分子每秒催化 6×105 CO2 与水结合成 H2CO3,比非酶促反应快 107 倍. 2.高度的特异性 酶对催化的底物有高度的选择性,即一种酶只作用一种或一类化合物,催化一定的化学反应,并生成一定的产物,这种特性称为酶的 特异性或专一性.有结构专一性和立体异构专一性两种类型. 结构专一性又分绝对专一性和相对专一性.前者只催化一种底物,进行一种化学反应.如脲酶仅催化尿素水解.后者可作用一类化合 物或一种化学键.如酯酶可水解各种有机酸和
醇形成的酯.在动物消化道中几种蛋白酶专一性不同,胰蛋白酶只水解 Arg 或 Lys 羧基形成 的肽键;胰凝乳蛋白酶水解芳香氨基酸及其它疏水氨基酸羧基形成的肽键. 立体异构专一性指酶对底物立体构型的要求.例如乳酸脱氢酶催化 L-乳酸脱氢为丙酮酸,对 D-乳酸无作用;L-氨基酸氧化酶只作用 L-氨基酸,对 D-氨基酸无作用. 3.酶活性的可调节性 酶促反应受多种因素的,通过改变酶的合成和降解速度可调节酶的含量;酶在胞液和亚细胞的隔离分布构成酶的区域化调节;代 谢物浓度或产物浓度的变化可以抑制或激活酶的活性;激素和神经系统的信息,可通过对关键酶的变构调节和共价修饰来影响整个酶促反 应速度.所以酶是催化剂又是代谢调节元件,酶水平的调节是代谢的基本方式. 4.酶的不稳定性 酶主要是蛋白质,凡能使蛋白质变性的理化因素均可影响酶活性,甚至使酶完全失活.酶催化作用一般需要比较温和的条件(37℃, 1atm,pH7) . 三,酶的分类与命名 (一)酶的分类 根据国际酶学委员会(International Enzyme Commission,IEC)的规定,按照酶促反应的性质,分为六大类: 1.氧化还原酶(oxidoreductases)催化底物进行氧化还原反应.如乳酸脱氢酶,琥珀酸脱氢酶,细胞色素氧化酶,过氧化氢酶,过氧 化物酶等. 2.转移酶(transferases)催化底物之间某些基团的转移或交换.如甲基转移酶,氨基转移酶,磷酸化酶等. 3.水解酶(hydrolases)催化底物发生水解反应.如淀粉酶,蛋白酶,核酸酶,脂肪酶等. 4.裂解酶(lyases)催化底物裂解或移去基团(形成双键的反应或其逆反应) .如碳酸酐酶,醛缩酶,柠檬酸合成酶等. 5.异构酶(isomerases) 催化各种同分异构体之间相互转化.如磷酸丙糖异构酶,消旋酶等. 6.合成酶(ligases) 催化两分子底物合成一分子化合物,同时偶联有 ATP 的分解释能.如谷氨酰胺合成酶,氨基酸-RNA 连接酶等. (二)酶的命名 1961 年,国际酶学委员会(IEC)主要根据酶催化反应的类型,把酶分为 6 大类,制定了系统命名法.规定每一酶只有一个系统名称,它 标明酶的所有底物与催化反应性质,底物名称之间以\": \"分隔,同时还有一个由 4 个数字组成的系统编号.如谷丙转氨酶的系统名称是 丙氨酸:α- 酮戊二酸氨基转移酶(酶表中的统一编号是 EC2.6.1.2) .乳酸脱氢酶的编号是 EC1.1.1.27. 酶的分子组成, 第二节 酶的分子组成,结构和功能一,酶的分子组成 (一)单纯酶和结合酶 单纯酶是仅由肽链构成的酶.如脲酶,一些消化蛋白酶,淀粉酶,脂酶,核糖核酸酶等. 结合酶由蛋白质部分和非蛋白质部分组成,前者称为酶蛋白(apoenzyme),决定酶的特异性和高效率;后者称为辅助因子(cofactor),决 定反应的种类和性质.两者结合形成的复合物称为全酶(holoenzyme) ,这两部分对于催化活性都是必需的. 酶蛋白有单条肽链和多个亚基组成的.前者称为单体酶,为数不多,均为水解酶,如胰蛋白酶,核糖核酸酶,溶菌酶等;多个相同或 不
同亚基以非共价键连接的酶称为寡聚酶,如磷酸化酶 a,3-磷酸甘油醛脱氢酶等. 细胞内存在着许多由几种不同功能的酶彼此嵌合形成的多酶复合体,即多酶体系,它利于一系列反应的连续进行,如丙酮酸脱氢酶体 系,脂肪酸合成酶复合体.在多酶体系中,能影响整条代谢途径方向和速度的酶称为关键酶,关键酶通常催化单向不平衡反应,或者是该 多酶体系中催化活性最低的限速酶. (二)酶的辅因子 酶的辅助因子指金属离子或小分子有机化合物(又称辅酶与辅基) . 1.金属离子 约 2/3 的酶含有金属离子,常见的是
K+,Na+,Mg2+,Cu2+(Cu+) ,Zn2+,Fe2+(Fe3+)等.金属离子的作用是多方面的:参与 酶的活性中心;在酶蛋白与底物之间起桥梁作用;维持酶分子发挥催化作用所必需的构象;中和阴离子,降低反应中的静电斥力. 2.辅酶与辅基 辅酶与辅基是一些化学稳定的小分子有机物,是维生素样的物质,参与酶的催化过程,在反应中传递电子,质子或一些基团. 辅酶与酶蛋白的结合疏松,可以用透析或超滤方法除去;辅基则与酶蛋白结合紧密,不能用上述方法除去.一种酶蛋白只能与一种辅 助因子结合成一种特异的酶,但一种辅助因子可以与不同的酶蛋白结合构成多种特异性酶,以催化各种化学反应. 维生素(Vitamin)是维持机体正常生命活动所必需的一类小分子有机物,基本不能在体内合成,即使有几种能自行合成,也因合成量 不足而必须从食物中摄取.维生素的需要量及缺乏症是营养学的课题. 维生素原意是\"生命中必不可少的胺\" ,波兰学者凡克把从米糠中提取出治疗脚气病有效的成分命名为维生素,现已发现 13 种,按溶 解性分为水溶性和脂溶性两大类.脂溶性维生素以发挥作用为主,A,D,E,K 具有一些特殊的生理功能. 以下 8 种水溶性的维生素都以辅酶的形式参与结合酶的组成.也有些本身就是辅酶,如硫辛酸,抗坏血酸. 含维生素的辅酶及其主要功能 维生素 辅酶形式 反应类型 硫胺素(B1) 焦磷酸硫胺素(TPP) α-酮酸氧化脱羧反应 核黄素(B2) 黄素单核苷酸(FMN) 黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD) 氧化还原反应 烟酸或烟酰胺(PP) 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+) 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+) 氧化还原反应 泛酸 辅酶 A(CoA-SH) 酰基转移反应 吡哆醇,吡哆醛,吡哆胺(B6) 磷酸吡哆醛,磷酸吡哆胺 转氨基作用,脱羧作用 生物素 生物胞素 CO2 的固定 叶酸 四氢叶酸 一碳单位转移 钴胺素(B12) 5'甲钴胺素 1,2 --氢原子转移 甲基转移 二,酶的活性部位 酶的活性部位(active site)是它结合底物和将底物转化为产物的区域,又称活性中心.它是由在线性多肽链中可能相隔很远的氨基酸 残基形成的三维小区(为裂缝或为凹陷) .酶活性部位的基团属必需基团,有二种:一是结合基团,其作用是与底物结合,生成酶-底物复 合物;二是催化基团,其作用是影响底物分子中某些化学键的稳定性,催化底物发生化学反应并促进底物转变成产物,也有的
必需基团同 时有这两种功能.还有一些化学基团位于酶的活性中心以外的部位,为维持酶活性中心的构象所必需,称为酶活性中心以外的必需基团. 构成酶活性中心的常见基团有组氨酸的咪唑基,丝氨酸的羟基,半胱氨酸的巯基等.如丝氨酸蛋白酶家族的胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶 和弹性蛋白酶, 都催化蛋白质的肽键使之水解, 但底物的专一性由它们的底物-结合部位中氨基酸基团的性质所决定, 与其作用的底物互补. 像胰蛋白酶,在它的底物-结合部位有带负电荷的 Asp 残基,可与底物侧链上带正电荷的 Lys 和 Arg 相互作用,切断其羧基侧;胰凝乳蛋 白酶在它的底物-结合部位有带小侧链的氨基酸残基,如 Gly 和 Ser,使底物庞大的芳香的和疏水氨基酸残基得以进入,切断其羧基侧;弹 性蛋白酶有相对大的 Val 和 Thr 不带电荷的氨基酸侧链,凸出在它的底物-结合部位,阻止了除 Ala 和 Gly 小侧链以外的所有其他氨基酸. 三,酶原激活 没有活性的酶的前体称为\"酶原\" ,酶原转变成酶的过程称为酶原激活.其实质是酶活性部位形成或暴露的过程.一些与消化作用有 关的酶,如胃蛋白酶,胰蛋白酶在最初合成和分泌时,没有催化活性.胃蛋白酶原在 H+作用下,自 N 端切下几个多肽碎片,形成酶催化 所需的空间结构,转化为胃蛋白酶.胰蛋白酶原随胰液进入小肠时被肠激酶激活,自 N 端切除一个 6 肽,促使酶的构象变化,形成活性中 心,转变成有活性的胰蛋白酶. 脱氧腺苷钴胺素 酶原的生物合成和酶原激活一般不在同一组织,细胞或细胞器中进行.酶原的激活具有重要的生理意义,不仅保护细胞本身不受酶的 水解破坏,而且保证酶在特定的部位与环境中发挥催化作用. 四,同工酶,变构酶,抗体酶 (一)同工酶(isozymes) 具有不同的分子形式但却催化相同的化学反应的一组酶称为同工酶.1959 年发现的第一个同工酶是乳酸脱氢酶(LDH) ,它在 NADH 存在下,催化丙酮酸的可逆转化生成乳酸.它是一个寡聚酶,由两种不同类型的亚基组成 5 种分子形式:H4,H3M,H2M2,HM3,M4, 它们的分子结构,理化性质和电泳行为不同,但催化同一反应,因为它们的活性部位在结构上相同或非常相似.M 亚基主要存在骨骼肌和 肝脏,而 H 亚基主要在心肌.心肌梗死的情况可通过血液 LDH 同工酶的类型的检测确定. (二)变构酶(allosteric enzyme) 变构酶又称别构酶,是一类调节代谢反应的酶.一般是寡聚酶,酶分子有与底物结合的活性部位和与变构剂非共价结合的调节部位, 具有变构效应.引起变构效应的物质称为变构效应剂.降低酶活性的称变构抑制剂或负效应物;反之,称为变构激活剂或正效应物.变构 酶与血红蛋白一样,存在着协同效应. 变构酶催化的反应速度与底物浓度的关系常呈 S 形曲线,这和非调节酶的动力学曲线——双曲线不同.变构酶多为限速酶.在多酶体 系,限速酶一般位于代谢途径的起点或分支点上,对控制反应总速度起关键作用.如异柠檬酸脱氢酶就是一个变构酶,是三羧酸
循环的关 键酶,NAD+,ADP 和柠檬酸是该酶的变构激活剂,而 NADH 和 ATP 是变构抑制剂. (三)抗体酶(abzyme) 既是抗体又具有催化功能的蛋白质称为\"抗体酶或催化性抗体\" ,其本质是免疫球蛋白,但是在易变区赋予了酶的属性.1986 年科学 家根据过渡态理论和免疫学原理,运用单克隆抗体技术成功地制备了具有酶活性的抗体.这加深了人们对酶作用原理的理解,而且在临床 医学及制药业等方面有很好的应用. 第三节 酶的作用机制一,酶的催化本质 现代化学反应速度理论是过渡态理论.在一个化学反应体系中,反应物从\"初态\" 到\"过渡态\" ,转变成产物即到达\"终态\"\"过渡 . 态\"是底物分子被激活的不稳定态,不同于反应中间物,它具有最高能量,又处在一个短暂的分子瞬间,某些化学键正在断裂和形成并达 到能生成产物或再返回生成反应物的程度. 酶催化的反应速度快是降低反应的能垒,即降低底物分子所必须具有的活化能.催化和非催化反应,其反应物和产物间总的标准自由 能差是一样的. 二,中间产物学说和诱导契合学说 酶的作用机制包含酶如何同底物结合以及怎样加快反应速度两个内容. 20 世纪初和 40 年代,科学家就提出了酶-底物复合物的形成和过渡态概念,即 E+S→ ES → E+P.酶和底物形成中间产物的学说已 为实验所证实,且分离到若干种 ES 结晶. 已有两种模型解释酶如何结合它的底物.14 年 Fischer 提出锁和钥匙模型,底物的形状和酶的活性部位彼此相适合,这是一种刚性 的和固定的组合.1958 年 Koshland 提出诱导契合模型,底物的结合在酶的活性部位诱导出构象变化;酶也可使底物变形,迫使其构象近 似于它的过渡态.这种作用是相互诱导,相互变形,相互适应的柔性过程. 酶的诱导契合 三,影响酶催化效率的因素 酶促反应高效率的原因常常是多种催化机制的综合应用,除酶-底物结合的诱导契合假说外,还有: (一)邻近效应与定向排列 在两个以上底物参与的反应中,由于酶的作用,底物被聚集到酶分子表面,彼此相互靠近并形成正确的定向关系,大大提高了底物的 局部浓度,底物被催化的部位定向地对准酶的活性中心,实际上是将分子间的反应变成类似于分子内的反应,从而大大提高催化效率. (二) 多元催化 酶分子中含有多种不同功能基团,如氨基,羧基,巯基,酚羟基,咪唑基等.既可作质子供体,又可作质子受体,使同一酶分子常可 起广义酸催化和碱催化;即可起亲核催化,又可起亲电子催化.这些因素并不是在所有的酶中同时都一样的起作用,对不同的酶起主要作 用的因素不完全相同. 第四节 酶促反应动力学酶促反应动力学是研究酶促反应的速率和影响此速率的各种因素的科学. 一,酶反应速度的测量 反应的速率也称速度(velocity) ,是以单位时间内反应物或生成物浓度的改变来表示.测定酶反应速度时,一般要求非常高的底物浓 度以使实验测定的起始反应速率与酶浓度成正比.以产物的生成量对时间作图,绘制反应过程曲线,不同时间的反
应速度就是时间为不同 值时曲线的斜率.通常采用反应的初速度 Vo,即以零时点为起点作一与曲线的线性部分相切的直线,这一直线的斜率即等于 Vo,这可以 避免底物浓度因被消耗而相对降低以及反应物堆积等因素对反应速度的抑制作用. (产物出现的速率或底物消失速率可根据特殊波长下吸 收光的变化用分光光度计测定. ) 二,酶浓度对反应速度的影响 当研究某一因素对酶促反应速度的影响时,体系中的其他因素保持不变,而只变动所要研究的因素. 当底物浓度远大于酶浓度时,酶促反应速度与酶浓度的变化成正比. 三,底物浓度对酶反应速度的影响 (一)米-曼氏方程式 1913 年, Michaelis 和 Menten 根据中间产物学说进行数学推导, 得出 V 与[S]的数学方程式, 即米-曼氏方程式. 1925 年 Briggs 和 Haldane 提出稳态理论,对米氏方程做了一项重要的修正. 底物浓度对酶促反应速度的影响呈双曲线.当底物浓度较低时,V 与[S]呈正比关系(一级反应) ;随着[S]的增高,V 的增加逐步减慢 (混合级反应) ;增到一定程度,V 不再增加而是趋于稳定(零级反应) . 当[S]<< Km 时,v = Vmax [S] /Km,反应速度与底物浓度成正比;当[S]>> Km 时 ,v≌Vmax,反应速度达到最大速度, 再增加[S]也不影响 V. (二)Km 的意义 1.当 V/v =2 时, Km =[S] , Km 是反应速率 v 等于最大速率 V 一半时的底物浓度,单位为摩尔/升(mol/L) . 2.Km =K2+K3/K1,当 K2>> K3 时,Km 值可用来表示酶对底物的亲和力.Km 值越小,酶与底物的亲和力越大;反之,则越小. 3.Km 是酶的特征性常数,它只与酶的结构和酶所催化的底物有关,与酶浓度无关. Km 和 Vmax 可用图解法根据实验数据测出. 通过测定在不同底物浓度下的 Vo, 再用 1/Vo 对 1/[S]的双倒数作图, 又称 Lineweaver-BurK 作图法,即取米氏方程式倒数形式. 四,pH 对反应速度的影响 每一种酶只能在一定限度的 pH 范围内才表现活力,酶表现最大活力时的 pH 称为酶的最适 pH.最适 pH 的微小偏离可使酶活性部位 的基团离子化发生变化而降低酶的活性,较大偏离时,维护酶三维结构的许多非共价键受到干扰,导致酶蛋白的变性. 酶的最适 pH 不是固定的常数,受酶的纯度,底物的种类和浓度,缓冲液的种类和浓度等的影响.一般酶的最适 pH 在 4~8 之间,植 物和微生物体内的酶最适 pH 多在 4.5~6.5,而动物体内的最适 pH 多在 6.5~8,多在 6.8 左右.但也有例外,如胃蛋白酶最适 pH 为 1.9,胰 蛋白酶的最适 pH 为 8.1, 肝精氨酸酶的最适 pH 为 9.0.Vo 对 pH 的关系图形是钟形曲线. 五,温度对反应速度的影响 温度对 Vo 关系的图形是一条曲线,它可清楚地表示出最适温度.多数哺乳动物的酶最适温度在 37℃左右,植物体内酶的最适温度在 50~60℃.也有些微生物的酶适应在高温或低温下工作.温度从两方面影响酶促反应速率,是升高温度提高反应速率和酶遇热易变性失活 两个相反效应间的平衡. 六,激活剂对反应速度的影响 凡能使酶由无
活性变为有活性或使酶活性增加的物质称为酶的激活剂(activator) .必需激活剂常是金属离子,如 Mg2+,K+,Mn2+ 等, Mg2+是多种激酶和合成酶的必需激活剂;非必需激活剂是有机化合物和 Cl-等,如胆汁酸盐是胰脂肪酶,Cl-是唾液淀粉酶的非必需激 活剂. 七,抑制剂对反应速度的影响 使酶活性下降而不导致酶变性的物质称为酶的抑制剂.抑制剂作用有可逆和不可逆抑制两类.以可逆抑制最为重要. (一) 不可逆抑制作用 这类抑制剂通常以共价键与酶活性中心上的必需基团相结合,使酶失活,一般不能用透析,超滤等物理方法去除.这类抑制作用可用 某些药物解毒,使酶恢复活性.如农药敌百虫,敌敌畏,1059 等有机磷化合物能特异地与胆碱酯酶活性中心的丝氨酸羟基结合,使酶失活, 导致乙酰胆碱不能水解而积存.迷走神经兴奋呈现中毒状态.解磷定(PAM)可解除有机磷化合物对羟基酶的抑制作用,显然这类解毒药 物和有机磷农药结合的强度大于和酶结合.重金属盐引起的巯基酶中毒,可用络合剂或加入其他过量的巯基化合物,如二巯基丙醇(BAL) 来解毒. (二) 可逆抑制作用 这类抑制剂通常以非共价键与酶可逆性结合,使酶活性降低或失活,采用透析,超滤的方法可去除抑制剂,恢复酶活性.可逆抑制有 竞争,非竞争,反竞争 3 种类型,以竞争性抑制研究的最多.三种作用的共同点是因 Km 和 Vmax 值的变化导致酶促反应初速度下降.竞 争性抑制剂的结构与底物类似,且在酶的同一部位(活性中心)和酶结合,仅在加大底物浓度时才逐渐抵消,显然 Km 值要增加,Vmax 不变.非竞争性抑制剂不直接影响酶与底物的结合,酶同时和二者结合生成的中间产物是三元复合物,也无正常产物生成,所以 Km 不变, 而 Vmax 减小.反竞争抑制剂促进酶与底物的结合,形成的三元复合物也不能形成正常产物,所以 Km 变小,Vmax 也变小. 药物是酶的抑制剂.竞争性抑制原理应用范例是磺胺药的研制.磺胺药和细菌合成叶酸所需的对氨基苯甲酸仅一个碳原子之别(变成 了 S) ,使细菌的叶酸不能正常合成,导致细菌的核苷酸合成受阻而死亡.而人以摄入叶酸为主,故磺胺药对人的核酸合成无影响. 第五节 酶的制备和应用一,酶的制备 酶可以从动物,植物,微生物等各种原料中提取或用微生物发酵法生产酶制剂.酶在生物体内与大量其他物质共同存在,含量很少, 又是有催化活性蛋白质,除了采用分离纯化蛋白质的一般方法,如盐析,有机溶剂沉淀,吸附,凝胶过滤,超离心法外,还要注意防止强 酸,强碱,高温和剧烈搅拌等,以避免酶活力的损失. 胞内酶和胞外酶的提取在处理方法上有所不同.胞内酶需要先用捣碎,砂磨,冻融,或自溶等方法将细胞破坏,然后再用适当的分离 纯化技术提出. 酶的活力(activity)就是酶加快其所催化的化学反应速度的能力.一般用催化反应的起始速率(Vo)表示,Vo 的单位是微摩尔/分, 也可用国际单位(U)和\"开特\" (Kat)表示.1 分钟内催化 1 微摩尔的作用物转变成产物的酶量为
1U;1 秒钟内催化 1 摩尔的作用物转 变成产物的酶量为 1Kat.1 微摩尔/分
=1U=16.67nKat(1Kat=6×107U) . 比较酶制剂的纯度可用比活力(specific activity),即每毫克蛋白质中所含的 U 数. 二,酶的应用 早在 19 世纪末,就有酶制剂的商品生产,目前已有 1 千多种,在工业,农业,医药以及科学研究中日益发挥它的巨大作用. 例如淀粉酶用于纺织品的退浆,可节约大量的碱并提高棉布的质量.处理饲料以增加其营养价值.脂肪酶用于食品增香,羊毛洗涤. 蛋白酶用于皮革业的脱毛,蚕丝脱胶,肉类嫩化,酒类澄清,洗涤剂去污等.葡萄糖异构酶用来制造果糖浆,葡糖氧化酶用来除去罐头中 残余的氧. 酶可作为试剂用于临床检验,如酶联免疫测定;作为药物用于临床治疗,如胃蛋白酶,胰蛋白酶助消化,链激酶,尿激酶治疗血栓的 形成;基因工程中应用各种性核酸内切酶进行科研和生产. 酶的开发和利用是现代生物技术的重要内容.1971 年命名了酶工程(enzyme engineering) ,这是把酶学原理与化学工程技术及基因重 组技术相结合而形成的新型应用技术.酶工程可分为化学酶工程和生物酶工程.前者指天然酶,化学修饰酶,固定化酶及人工模拟酶的研 究和生产;后者指克隆酶,突变酶和合成新酶等内容的研究和应用. 第四章 新陈代谢总论与生物氧化教学目标: 教学目标: 1. 掌握新陈代谢的概念与特点,了解新陈代谢研究方法.了解生物体内能量代谢的基本规律. 2. 掌握生物氧化的概念,特点,部位,主要酶类和体系.熟悉生物氧化中二氧化碳,水的生成,掌握呼吸链的组成,类型和传递体顺 序. 3. 掌握氧化磷酸化的概念,类型,偶联部位和 P/O 比值,熟悉影响氧化磷酸化因素,胞液中 NADH 的氧化和偶联机制. 第一节 新陈代谢总论一,新陈代谢的概念与特点 生物体是一个与环境保持着物质,能量和信息交换的开放体系.通过物质交换建造和修复生物体(按人的一生计,交换物质的总量约为 体重的 1200 倍,人体所含的物质平均每 10 天更新一半) .通过能量交换推动生命运动,通过信息交换进行,保持生物体和环境的适应. 新陈代谢(metabolism)是指生物与外界环境进行物质交换和能量交换的全过程.包括生物体内所发生的一切合成和分解作用(即同 化作用和异化作用) . 人和动物的物质代谢分为三个阶段:食物,水,空气进入机体(摄取营养物的消化和吸收) ,中间代谢和代谢产物的排泄.中间代谢 是指物质在细胞中的合成与分解过程,合成是吸能反应,分解是放能反应.它们是矛盾对立和统一的.所以,新陈代谢的功能是:从周围 环境中获得营养物质;将营养物质转变为自身需要的结构元件;将结构元件装配成自身的大分子;形成或分解生物体特殊功能所需的生物 分子;提供机体生命活动所需的一切能量. 各种生物具有各自特异的新陈代谢类型,这决定于遗传和环境条件.绿色植物及某些细菌有光合作用,若干种细菌有固氮作用,是自 养型的;动物与人是异养生物,同化作用必须从
外界摄取营养物质,通过消化吸收进入中间代谢.同一生物体的各个器官或不同组织还具 有不同的代谢方式. 各种生物的新陈代谢过程虽然复杂,却有共同的特点: 1.生物体内的绝大多数代谢反应是在温和条件下,由酶催化进行的. 2.物质代谢通过代谢途径,在一定的部位,严格有序地进行.各种代谢途径彼此协调组成有规律的反应体系(网络) . 3.生物体对内外环境条件有高度的适应性和灵敏的自动调节. 二,新陈代谢的研究方法 代谢途径的研究比较复杂,可从不同水平,主要对中间代谢进行研究.新陈代谢途径的阐明凝集了许多科学家的智慧与实验成果.如 1904 年德国化学家 Knoop 提出的脂肪酸的β氧化学说,1937 年 Krebs 提出的柠檬酸循环. 1.活体内(in vivo)和活体外(in vitro)实验 2.同位素示踪法和核磁共振波谱法(NMR) 3.代谢途径阻断法 三,生物体内能量代谢的基本规律 1.服从热力学原理.热力学第一定律是能量守恒定律,热力学第二定律指出,热的传导自高温流向低温.机体内的化学反应朝着达到 其平衡点的方向进行. 2.生化反应最重要的热力学函数是吉布斯自由能 G .自由能是在恒温,恒压下,一个体系作有用功的能力的度量.用于判断反应可否 自发进行,是放能或耗能反应. ΔG<0,表示体系自由能减少,反应可以自发进行,但是不等于说该反应一定发生或以能觉察的速率进行,是放能反应. ΔG>0,反应不能自发进行,吸收能量才推动反应进行. ΔG=0,体系处在平衡状态. 自由能与另外两个函数有关,ΔG=ΔH - TΔS(ΔH 是总热量的变化,ΔS 是总熵的改变,T 是体系的绝对温度) . 标准自由能变化用ΔGO'表示(25OC,1 个大气压,pH 为 7,反应物和产物浓度为 1mol/L 时所测得,单位是 kJ/mol) . 3.ΔGO'和化学平衡的关系 ΔG = ΔGO'+ RT ln[C][D]/[A][B] ΔG=0 时,ΔGO'= - RTln[C][D]/[A][B]= -RTlnK= -2.303RTlgK (R 为气体常数,lnK 为平衡常数的自然对数.K>1,ΔGO'为负值,反应趋于生成物的方向进行;K<1,ΔGO'为正值. ) 注意:ΔG 只取决于产物与反应物的自由能之差,与反应历程无关.总自由能变化等于各步反应自由能变化的代数和.热力学上不利 的吸能反应可以偶联放能反应来推动以保持代谢途径一连串反应的进行. 四,高能化合物与 ATP 的作用 高能化合物(high-energy compound)指化合物含有的自由能特多,且随水解反应或基团转移反应释放.最重要的有高能磷酸化合物, 还有硫酯类和甲硫类高能化合物.高能磷酸化合物的酸酐键常用～P 表示,水解时释放的自由能大于 20kJ,称为高能磷酸键.生化中\"高 能键\"的含义与化学中的\"键能\"完全不同. \"键能\"指断裂一个化学键需提供的能量. ATP 是细胞内特殊的自由能载体. 在标准状况, ATP 水解为 ADP 和 Pi 的ΔGO' =-30kJ/mol, 水解为 AMP 和 PPi 的ΔGO' =-32kJ/mol. ATP 的ΔGO'在所有的含磷酸基团的化合物中处于中间位置,这使 ATP 在机体起作中间传递能量的作用,称
之能量的共同中间体.机体 内一些在热力学上不可能发生的反应,只需与 ATP 分子的水解相偶联,就可使其进行.所以说,ATP 又是生物细胞能量代谢的偶联剂. 从低等的单细胞生物到高等的人类,能量的释放,储存和利用都是以 ATP 为中心.ATP 是整个生命世界能量交换的通用货币.ATP 是能量的携带者或传递者,而不是储存者.在脊椎动物中起能量储存的是磷酸肌酸(phosphoccreatine,PC) ,在无脊椎动物中是磷酸精氨 酸. ATP 和其他的核苷三磷酸——GTP,UTP,CTP 常称作富含能量的代谢物.它们几乎有相同的水解(或形成)的标准自由能,核苷酸 之间的磷酰基团的转移的平衡常数接近 1.0,所以计算物质代谢能量时,消耗的其他核苷三磷酸用等价的 ATP 表示. 第二节 生物氧化一,生物氧化的概念,特点和部位 1.概念:有机物质在生物体细胞内氧化分解产生二氧化碳,水,并释放出大量能量的过程称为生物氧化(biological oxidation) .又称细 胞呼吸或组织呼吸. 2.特点:生物氧化和有机物质体外燃烧在化学本质上是相同的,遵循氧化还原反应的一般规律,所耗的氧量,最终产物和释放的能量 均相同. (1)在细胞内,温和的环境中经酶催化逐步进行. (2)能量逐步释放.一部分以热能形式散发,以维持体温,一部分以化学能形式储存供生命活动能量之需(约 40%) . (3)生物氧化生成的 H2O 是代谢物脱下的氢与氧结合产生,H2O 也直接参与生物氧化反应;CO2 由有机酸脱羧产生. (4)生物氧化的速度由细胞自动. 3.部位:在真核生物细胞内,生物氧化都是在线粒体内进行,原核生物则在细胞膜上进行. 二,生物氧化的酶类和体系 1.酶类:重要的为氧化酶和脱氢酶两类,脱氢酶尤为重要. 氧化酶为含铜或铁的蛋白质,能激活分子氧,促进氧对代谢物的直接氧化,只能以氧为受氢体,生成水.重要的有细胞色素氧化酶, 可使还原型氧化成氧化型,亦可将氢放出的电子传递给分子氧使其活化.心肌中含量甚多.此外还有过氧化物酶,过氧化氢酶等. 脱氢酶分需氧脱氢酶和不需氧脱氢酶.前者可激活代谢物分子中的氢,与分子氧结合,产生过氧化氢.在无分子氧时,可利用亚甲 蓝为受氢体.需氧脱氢酶皆以 FMA 或 FAD 为辅酶.不需氧脱氢酶可激活代谢物分子中的氢,使脱出的氢转移给递氢体或非分子氧.一般 在无氧或缺氧环境下促进代谢物氧化.大部分以 NAD 或 NADP 为辅酶. 2.体系:有不需传递体和需传递体的两种体系. 不需传递体的最简单,在微粒体,过氧化酶体及胞液中代谢物经氧化酶或需氧脱氢酶作用后脱出的氢给分子氧生成水或过氧化氢. 其特点是不伴磷酸化,不生成 ATP,主要与体内代谢物,药物和毒物的生物转化有关. 需传递体的最典型的是呼吸链.是在线粒体经多酶体系催化,即通过电子传递链完成,与 ATP 的生成相关. 三,生物氧化中二氧化碳的生成 生物氧化中 CO2 的生成是代谢中有机酸的脱羧反应所致.有直接脱羧和氧化脱羧两种类型.按脱羧基的位置又有α-脱羧和β-脱羧之 分.请
判断以下脱羧反应的类型? 四,生物氧化中水的生成 (一)呼吸链的概念和类型 代谢物上的氢原子被脱氢酶激活脱落后,经过一系列的传递体,最后与激活的氧结合生成水的全部体系,此过程与细胞呼吸有关,所 以将此传递链称为呼吸链(respiratory chain)或电子传递链(electron transfer chain) . 在呼吸链中,酶和辅酶按一定顺序排列在线粒体内膜上.其中传递氢的酶或辅酶称为递氢体,传递电子的酶或辅酶称为电子传递体. 递氢体和电子传递体都起着传递电子的作用(2H→2H++2e) . 生物体内的呼吸链有多种型式.人体细胞线粒体内最重要的有两条,即 NADH 氧化呼吸链和琥珀酸氧化呼吸链.它们的初始受氢体, 生成 ATP 的数量及应用有差别.NADH 氧化呼吸链应用最广,糖,脂,蛋白质三大物质分解代谢中的脱氢氧化反应,绝大多数是通过该 呼吸链来完成的.琥珀酸氧化呼吸链在 Q 处与上述 NADH 氧化呼吸链途径交汇.其脱氢黄酶只能催化某些代谢物脱氢,不能催化 NADH 或 NADPH 脱氢. (二)呼吸链的组成 组成呼吸链的成分已发现 20 余种,分为 5 大类. 1.辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ 辅酶Ⅰ(NAD+或 CoⅠ)为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸.辅酶Ⅱ(NADP+或 CoⅡ)为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸.它们是不需氧脱氢酶 的辅酶,分子中的烟酰胺部分,即维生素 PP 能可逆地加氢还原或脱氢氧化,是递氢体.以 NAD+作为辅酶的脱氢酶占多数. 2.黄素酶 黄素酶的种类很多,辅基有 2 种,即 FMN 和 FAD.FMN 是 NADH 脱氢酶的辅基,FAD 是琥珀酸脱氢酶的辅基,都是以核黄素为中 心构成的,其异咯嗪环上的第 1 位及第 5 位两个氮原子能可逆地进行加氢和脱氢反应,为递氢体. 3.铁硫蛋白 分子中含有非血红素铁和对酸不稳定的硫,因而常简写为 FeS 形式.在线粒体内膜上,常与其他递氢体或递电子体构成复合物,复合 物中的铁硫蛋白是传递电子的反应中心,亦称铁硫中心,与蛋白质的结合是通过 Fe 与 4 个半胱氨酸的 S 相连接. 4.泛醌(又名辅酶 Q) 一类广泛分布于生物界的脂溶性醌类化合物.分子中的苯醌为接受和传递氢的核心,其 C-6 上带有异戊二烯为单位构成的侧链,在哺 乳动物,这个长链为 10 个单位,故常以 Q10 表示. 5.细胞色素类 细胞色素(cytochrome, Cyt)是一类以铁卟啉为辅基的结合蛋白质,存在于生物细胞内,因有颜色而得名.已发现的有 30 多种,按吸 收光谱分 a,b,c 三类,每类又有好多种. Cyta 和 a3 结合紧,迄今尚未分开,故写成 aa3,位于呼吸链的终末部位,其辅基为血红素 A,传递电子的机制是以辅基中铁价的变 化 Fe3+ →Fe2+,a3 还含有铜离子,把电子直接交给分子氧 Cu+ →Cu2+,所以 a3 又称细胞色素氧化酶.a3 中的铁原子可以与氧结合, 也可以与氰化物离子(CN—) ,CO 等结合,这种结合一旦发生,a3 便失去使氧还原的能力,电子传递中止,呼吸链阻断,导致机体不能 利用氧而窒息死亡. (三)呼吸链中传递体的顺序 呼吸链中氢和电子的传递有着严格的顺序和方向.
根据氧化还原原理,氧化-还原电势 E 是物质对电子亲和力的量度,电极电位的高 低反映电子得失的倾向,E O'值愈低的氧还对(A/AH2)释放电子的倾向愈大,愈容易成为还原剂而排在呼吸链的前面.所以 NADH 还 原能力最强,氧分子的氧化能力最强.电子的自发流向是从电极电位低的物质(还原态)到电位高的氧化态,目前一致认可的是按标准氧 还电位递增值依次排列. 电子由 NADH 的传递到氧分子通过 3 个大的蛋白质复合体,即 NADH 脱氢酶,细胞色素 bc1 复合体和细胞色素氧化酶到氧(又称复 合体Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ) .电子从 FADH2 的传递是通过琥珀酸-辅酶 Q 还原酶(复合体Ⅱ)经 Q,复合体Ⅲ,Ⅳ到氧(琥珀酸-辅酶 Q 还原酶催化 的反应的自由能变化太小) . 第三节 氧化磷酸化 一,氧化磷酸化的概念和偶联部位 1.概念:氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)是指在生物氧化中伴随着 ATP 生成的作用.有代谢物连接的磷酸化和呼吸链连接 的磷酸化两种类型. ATP 生成方式有两种. 即 一种是代谢物脱氢后, 分子内部能量重新分布, 使无机磷酸酯化先形成一个高能中间代谢物, 促使 ADP 变成 ATP.这称为底物水平磷酸化.如 3-磷酸甘油醛氧化生成 1,3-二磷酸甘油酸,再降解为 3-磷酸甘油酸.另一种是在呼吸链 电子传递过程中偶联 ATP 的生成.生物体内 95%的 ATP 来自这种方式. 2.偶联部位: 根据实验测定氧的消耗量与 ATP 的生成数之间的关系以及计算氧化还原反应中ΔGO' 和电极电位差ΔE 的关系可以证明. P/O 比值是指代谢物氧化时每消耗 1 摩尔氧原子所消耗的无机磷原子的摩尔数,即合成 ATP 的摩尔数.实验表明, NADH 在呼吸链 被氧化为水时的 P/O 值约等于 3,即生成 3 分子 ATP;FADH2 氧化的 P/O 值约等于 2,即生成 2 分子 ATP. 氧-还电势沿呼吸链的变化是每一步自由能变化的量度.根据ΔGO'= - nFΔE O'(n 是电子传递数,F 是法拉第常数),从 NADH 到 Q 段电位差约 0.36V,从 Q 到 Cytc 为 0.21V,从 aa3 到分子氧为 0.53V,计算出相应的ΔGO'分别为 69.5,40.5,102.3kJ/mol.于是普遍认 为下述 3 个部位就是电子传递链中产生 ATP 的部位. NADH→NADH 脱氢酶→‖Q → 细胞色素 bc1 复合体→‖Cytc →aa3→‖O2 二,胞液中 NADH 的氧化 糖代谢中的三羧酸循环和脂肪酸β-氧化是在线粒体内生成 NADH(还原当量) ,可立即通过电子传递链进行氧化磷酸化.在细胞的 胞浆中产生的 NADH ,如糖酵解生成的 NADH 则要通过穿梭系统(shuttle system)使 NADH 的氢进入线粒体内膜氧化. (一)α-磷酸甘油穿梭作用 这种作用主要存在于脑,骨骼肌中,载体是α-磷酸甘油. 胞液中的 NADH 在α-磷酸甘油脱氢酶的催化下,使磷酸二羟丙酮还原为α-磷酸甘油,后者通过线粒体内膜,并被内膜上的α-磷 酸甘油脱氢酶(以 FAD 为辅基)催化重新生成磷酸二羟丙酮和 FADH2,后者进入琥珀酸氧化呼吸链.葡萄糖在这些组织中彻底氧化生成 的 ATP 比其
他组织要少,1 摩尔 G→36 摩尔 ATP. (二)苹果酸-天冬氨酸穿梭作用 主要存在肝和心肌中.1 摩尔 G→38 摩尔 ATP 胞液中的 NADH 在苹果酸脱氢酶催化下,使草酰乙酸还原成苹果酸,后者借助内膜上的α-酮戊二酸载体进入线粒体,又在线粒体内 苹果酸脱氢酶的催化下重新生成草酰乙酸和 NADH.NADH 进入 NADH 氧化呼吸链,生成 3 分子 ATP.草酰乙酸经谷草转氨酶催化生成 天冬氨酸,后者再经酸性氨基酸载体转运出线粒体转变成草酰乙酸. 三,氧化磷酸化偶联机制 (一)化学渗透假说(chemiosmotic hypothesis) 1961 年,英国学者 Peter Mitchell 提出化学渗透假说(1978 年获诺贝尔化学奖) ,说明了电子传递释出的能量用于形成一种跨线粒 体内膜的质子梯度(H+梯度) ,这种梯度驱动 ATP 的合成.这一过程概括如下: 1.NADH 的氧化,其电子沿呼吸链的传递,造成 H+ 被 3 个 H+ 泵,即 NADH 脱氢酶,细胞色素 bc1 复合体和细胞色素氧化酶从线粒 体基质跨过内膜泵入膜间隙. 2.H+ 泵出,在膜间隙产生一高的 H+ 浓度,这不仅使膜外侧的 pH 较内侧低(形成 pH 梯度) ,而且使原有的外正内负的跨膜电位增 高,由此形成的电化学质子梯度成为质子动力,是 H+ 的化学梯度和膜电势的总和. 3.H+ 通过 ATP 合酶流回到线粒体基质,质子动力驱动 ATP 合酶合成 ATP. (二)ATP 合酶 ATP 合酶由两部分组成(Fo-F1) ,球状的头部 F1 突向基质液,水溶性.亚单位 Fo 埋在内膜的底部,是疏水性蛋白,构成 H+ 通道. 在生理条件下,H+ 只能从膜外侧流向基质,通道的开关受柄部某种蛋白质的调节. 四,影响氧化磷酸化的因素 (一)抑制剂 能阻断呼吸链某一部位电子传递的物质称为呼吸链抑制剂. 鱼藤酮,安密妥在 NADH 脱氢酶处抑制电子传递,阻断 NADH 的氧化,但 FADH2 的氧化仍然能进行. 抗霉素 A 抑制电子在细胞色素 bc1 复合体处的传递. 氰化物,CO,叠氮化物(N3-)抑制细胞色素氧化酶. 对电子传递及 ADP 磷酸化均有抑制作用的物质称氧化磷酸化抑制剂,如寡霉素. (二)解偶联剂 2,4-二硝基苯酚(DNP)和颉氨霉素可解除氧化和磷酸化的偶联过程,使电子传递照常进行而不生成 ATP.DNP 的作用机制是作 为 H+的载体将其运回线粒体内部,破坏质子梯度的形成.由电子传递产生的能量以热被释出. (三)ADP 的调节作用 正常机体氧化磷酸化的速率主要受 ADP 水平的调节,只有 ADP 被磷酸化形成 ATP,电子才通过呼吸链流向氧.如果提供 ADP,随着 ADP 的浓度下降,电子传递进行,ATP 在合成,但电子传递随 ADP 浓度的下降而减缓.此过程称为呼吸控制,这保证电子流只在需要 ATP 合成时发生. 第五章教学目标: 教学目标: 糖代谢 1.掌握糖类的结构,生理功能和酶促降解有关酶类. 2.掌握糖酵解,有氧氧化的基本过程,限速酶,ATP 的生成,生理意义与调节. 3.了解磷酸戊糖途径的基本过程,生理意义. 4.熟悉糖的合成反应基本过程,掌握糖异生的概念与反应过程,关键酶,生理意义及调节.
导入:糖是自然界分布广泛,数量最多的有机化合物.尤以植物含量最多,约为 85%~95%.糖在生命活动中主要作用是提供能量和 碳源.人体所需能量的 50%~70%来自于糖.食物中的糖类主要是淀粉,被机体消化成其基本组成单位葡萄糖后,以主动的方式被吸收入 血.本章重点讨论葡萄糖在机体内的代谢. 第一节 概论一,糖类的结构与功能 1.糖类的结构 糖定义为多羟基醛,酮及其缩聚物和某些衍生物.有单糖,寡糖,多糖和复合糖类. 单糖是糖结构的单体,可用一个经验公式(CH2O)n 数目为 n-2,异构体的数目为 2n-2. 糖的构型有 D 型和 L 型.D 型糖是指具有最高编号的手性碳,即离羰基碳最远的手性碳连接的- OH 在 Fischer 投影式中是朝向右的. 醛糖和酮糖可以形成环式的半缩醛.有 5 员环或 6 员环结构,称为呋喃糖或吡喃糖.环化单糖中氧化数最高的碳原子称异头碳,是手 性碳,又有α ,β两个新异构体(称为异头物) .在溶液中,有能力形成环结构的醛糖和酮糖,它们不同的环式和开链式处于平衡中. 单糖存在不同的构象.对于每个吡喃糖,都存在 6 种不同的船式构象和 2 种不同的椅式构象.在椅式构象中可以使环内原子的立体排 斥减到最小,所以椅式构象比船式更稳定. 单糖可以通过糖苷键形成寡糖和多糖.最常见的糖苷键是α-1,4 和β-1,4,另一种糖苷键α-1,6 出现在支链淀粉和糖原分子中.4 种重要的双糖有麦芽糖(α-1,4) ,纤维二糖(β-1,4) ,乳糖和蔗糖.乳糖是纤维二糖的差向异构体,是奶中的主要糖分.许多植物可 合成蔗糖,它是自然界中发现的最丰富的糖(无还原性和变旋现象) . 淀粉,糖原是葡萄糖的同多糖.淀粉是植物和真菌中的储存多糖,糖原是在动物和细菌中发现的储存多糖.纤维素和几丁质是结构同 多糖. 直链淀粉含α-1,4 糖苷键,支链淀粉和糖原中除含α-1,4 糖苷键外,在分支点上还有α-1,6 糖苷键.糖原分子一般比淀粉分子大, 分支多,但侧链含有的葡萄糖残基较少.纤维素中的葡萄糖残基通过β-1,4 糖苷键连接.几丁质的单糖单位是β-1,4 糖苷键连接的 N乙酰葡萄糖胺. 单糖和大多数多糖是还原糖.都含有一个可反应的羰基,容易被较弱的氧化剂(如 Fe3+或 Cu2+)氧化.一个糖聚合物的还原能力, 根据寡糖和多糖的聚合链的还原端和非还原端判断,在一个线形的聚合糖中,有一个还原端残基(含游离异头碳的残基)和一个非还原端 残基.一个带支链的多糖含有很多非还原端,但只有一个还原端. 2.糖的生理功能 1 摩尔的葡萄糖完全氧化为 CO2 和 H2O 可释放 2840kJ(679kcal)的能量,其中约 40%转移至 ATP,供机体生理活动能量之需.糖类 代谢的中间产物可为氨基酸,核苷酸,脂肪酸,类固醇的合成提供碳原子或碳骨架.如糖的磷酸衍生物可以形成许多重要的生物活性物质, 如 NAD+,FAD,ATP 等. 糖决定了人的血型,一个血球细胞的表面有 50 万个糖蛋白分子.糖是细胞膜上\"受体\"分子的组成部分,是细胞识别,信息传递的 参与者.由
于单糖有异构物,异头物和多羟基等特点,可以形成种类繁多的不同结构,以致糖链的生物信息容量超过肽链和多核苷酸链. 二,多糖和低聚糖的酶促降解 糖代谢指糖在生物体内的分解与合成.是研究最早,代谢途径了解最祥细的.分解代谢包括多糖和低聚糖的酶促降解和单糖的氧化放 能过程.合成代谢指绿色植物和光合微生物的光合作用合成葡萄糖,进而合成淀粉.对于人和动物来说,则是利用葡萄糖合成糖原或利用 非糖物转化为糖. 多糖和低聚糖在被生物体利用之前必须水解成单糖. 1.淀粉(或糖原)的酶促降解 表示.一般分为醛糖和酮糖两类.最简单的三碳糖是甘油醛和二羟基丙酮.醛 糖中氧化数最高的碳原子指定为 C-1,酮糖中氧化数最高的碳原子指定为 C-2,除最简单的二羟丙酮外,都是手性分子.醛糖中手性碳的 人类食物中的糖主要有淀粉,糖原,麦芽糖,蔗糖,乳糖,葡萄糖,果糖及纤维素等,一般以淀粉为主.水解淀粉和糖原的酶有α, β淀粉酶(只表示两种酶,不表示任何构型关系) .α-淀粉酶主要存在于动物体(唾液和胰液中) ,β-淀粉酶主要存在于植物种子和块根 内.它们均作用于α-1,4 糖苷键,但后者只能从非还原端水解.水解产物是麦芽糖.水解淀粉中α-1,6 糖苷键的酶是α-1,6 糖苷键酶, 如植物中的 R-酶和小肠粘膜的α-糊精酶.小肠粘膜细胞还有寡糖酶和双糖酶,如麦芽糖酶,乳糖酶,蔗糖酶等,属于糖苷酶类. 淀粉和糖原在细胞内的降解是经磷酸化酶的磷酸解作用生成葡糖-1-磷酸,再经葡聚糖转移酶和糖原脱支酶除去α-1,6 分支,产生的 G-1-P 由磷酸葡萄糖变位酶转化为 G-6-P.G-6-P 的命运决定于组织,肝脏含 G-6-P 酶,使其转化为 G,葡萄糖是血糖的主要来源,正常人 在安静空腹(停食 12～14h)状态下,血糖浓度是较恒定的,一般在 4.4～6.7mmol/L 之间,所以肝糖原用于维持血糖水平.而肌肉组织不 含 G-6-P 酶,肌糖原不能分解成葡萄糖,只能进行糖酵解或有氧氧化. 2.纤维素的酶促降解 人的消化道无水解纤维素的酶 ( 细菌,真菌,放线菌,原生动物等能产生纤维素酶及纤维二糖酶,水解纤维素成葡萄糖 ),但纤维素 促进肠道蠕动,有防止便秘的功用. 第二节 糖的分解代谢 一,糖的分解特点和途径 1.糖的分解在有氧和无氧下均可进行,无氧分解不彻底,有氧分解是其继续,最终分解产物是 CO2,H2O 和能量. 2.糖的分解先要活化,无氧下的分解以磷酸化方式活化;有氧下,以酰基化为主. 3.在动物和人体内,糖的分解途径主要有 3 条:糖酵解(葡萄糖→丙酮酸→乳酸) ;柠檬酸循环(丙酮酸 →乙酰辅酶 A→CO2+H2O) ; 戊糖磷酸途径(葡萄糖→核糖-5-磷酸→CO2+H2O) .植物体中乙醛酸循环是柠檬酸循环的支路. 二,糖酵解 (一)概念和部位 糖酵解(glycolysis)是无氧条件下,葡萄糖降解成丙酮酸并有 ATP 生成的过程.它是生物细胞普遍存在的代谢途径,涉及十个酶催化反 应,均在胞液. (二)反应过程和关键酶 1.己糖激酶(hexokinase)催化葡萄糖生
成 G-6-P,消耗一分子 ATP. 己糖激酶(HK)分布较广,而葡萄糖激酶(GK)只存在于肝脏,这是第一个关键酶催化的耗能的限速反应.若从糖原开始,由磷酸 化酶和脱支酶催化生成 G-1-P,再经变位酶转成 G-6-P. 2.G-6-P 异构酶催化 G-6-P 转化为 F-6-P. 3.磷酸果糖激酶(PFK-Ⅰ)催化 F-6-P 磷酸化生成 F-1,6-DP,消耗一分子 ATP.这是第二个关键酶催化的最主要的耗能的限速反应. 4.醛缩酶裂解 F-1, 6-DP 为磷酸二羟丙酮和甘油醛-3-磷酸. 平衡有利于逆反应方向, 但在生理条件下甘油醛-3-磷酸不断转化成丙酮酸, 驱动反应向裂解方向进行. 5.丙糖磷酸异构酶催化甘油醛-3-磷酸和磷酸二羟丙酮的相互转换. 6.甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化甘油醛-3-磷酸氧化为 1,3 -二磷酸甘油酸.这是酵解中唯一的一步氧化反应,是由一个酶催化的脱氢和磷 酸化两个相关反应.反应中一分子 NAD+被还原成 NADH,同时在 1,3-二磷酸甘油酸中形成一个高能酸酐键,为在下一步酵解反应中使 ADP 变成 ATP. 7.磷酸甘油酸激酶催化 1,3-二磷酸甘油酸生成 3-磷酸甘油酸.反应(6)和反应(7)联合作用,将一个醛氧化为一个羧酸的反应与 ADP 磷酸化生成 ATP 偶联.这种通过一高能化合物将磷酰基转移 ADP 形成 ATP 的过程称为底物水平磷酸化.底物水平磷酸化不需氧,是 酵解中形成 ATP 的机制. 8.磷酸甘油酸变位酶催化 3-磷酸甘油酸转化为 2-磷酸甘油酸 9.烯醇化酶催化 2-磷酸甘油酸生成磷酸烯醇式丙酮酸(PFP) .PFP 具有很高的磷酰基转移潜能,其磷酰基是以一种不稳定的烯醇式互 变异构形式存在的. 10.丙酮酸激酶催化 PFP 生成丙酮酸和 ATP.这是第三个关键酶催化的限速反应.也是第二次底物水平磷酸化反应. 丙酮酸是酵解中第一个不再被磷酸化的化合物.其去路:在大多数情况下,可通过氧化脱羧形成乙酰辅酶 A 进入柠檬酸循环;在某些 环境条件(如肌肉剧烈收缩) ,乳酸脱氢酶可逆地将丙酮酸还原为乳酸;在酵母,厌氧条件下经丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶催化,丙酮酸 转化成乙醇(酒精发酵) . 葡萄糖+2Pi+2ADP+2NAD+ → 2 丙酮酸+2ATP+2NADH+2H++2H2O 葡萄糖+2Pi+2ADP+2H+ → 2 乳酸+2ATP+2H2O 葡萄糖+2Pi+2ADP+2H+ → 2 乙醇+2CO2+2ATP+2H2O (三)糖酵解能量的估算和生理意义 在体外,1mol 葡萄糖→2mol 乳酸,ΔGO'= -196kJ/mol 1mol 糖原→2mol 乳酸, ΔGO'= -183kJ/mol 在机体内,生成 2molATP 相当捕获 2×30.514=61.028 kJ/mol 葡萄糖酵解获能效率=2×30.514/196×100% = 31% 糖原酵解获能效率
=3×30.514/196×100% = 49.7% 糖酵解是生物界普遍存在的供能途径,其生理意义是为机体在无氧或缺氧条件下(应激状态)提供能量满足生理需要.例如,剧烈运 动时,肌肉内 ATP 大量消耗,糖酵解加速可迅速得到 ATP;成熟的红细胞没有线粒体,完全靠糖酵解供能;神经细胞,白细胞,骨髓,视 网膜细胞代谢极为活跃,不缺氧时亦由糖酵解提供部分能量. (四)糖酵
解的 糖酵解三个主要部位,分别是己糖激酶,果糖磷酸激酶(PFK)和丙酮酸激酶催化的反应. HK 被 G-6-P 变构抑制,这种抑制导致 G-6-P 的积累,酵解作用减弱.但 G-6-P 可转化为糖原及戊糖磷酸,因此 HK 不是最关键的限 速酶. PFK 被 ATP 变构抑制,但这种抑制作用被 AMP 逆转,这使糖酵解对细胞能量需要得以应答.当 ATP 供应短缺(和 AMP 充足)时, 加快速度,生成更多的 ATP, ATP 足够时就减慢速度.柠檬酸可增加 ATP 对酶的抑制作用;F-2,6-DP 可消除 ATP 对酶的抑制效应,使 酶活化.PFK 被 H+抑制,可防止肌乳酸过量导致的血液酸中毒. 丙酮酸激酶被 F-1,6-DP 活化,加速酵解.ATP,丙氨酸变构抑制此酶. 三,糖的有氧分解 (一)概念和部位 葡萄糖的有氧分解是从葡萄糖到丙酮酸经三羧酸循环(TCA) ,彻底氧化生成 CO2,H2O 和释放大量能量的过程.是在细胞的胞液和 线粒体两个部位进行的. (二)反应过程和关键酶 整个过程可分为三个阶段: 第一阶段是葡萄糖分解为丙酮酸,在胞液进行.与酵解反应过程所不同的是 3- 磷酸甘油醛脱氢生成的 NADH 进入线粒体氧化. 第二阶段是丙酮酸进入线粒体氧化脱羧生成乙酰 CoA. 丙酮酸脱氢酶系是由 3 种酶和 5 种辅助因子组成的多酶复合体,是关键酶.整个过程中无游离的中间产物,是个不可逆的连续过程. 第三阶段是柠檬酸循环(又称三羧酸循环或 Krebs 循环,1937 年提出,1953 年获诺贝尔奖) .此循环有 8 步酶促反应: 1.柠檬酸合成酶催化乙酰 CoA 与草酰乙酸缩合成柠檬酸和 CoASH.是第一个关键酶催化的限速反应. 2.顺乌头酸酶催化柠檬酸异构成异柠檬酸. 3.异柠檬酸在异柠檬酸脱氢酶的催化下生成草酰琥珀酸,再脱羧生成α-酮戊二酸.此步是第一次氧化脱羧,异柠檬酸脱氢酶是第二个 关键酶. 4.α- 酮戊二酸由α- 酮戊二酸脱氢酶系催化氧化脱羧生成琥珀酰 CoA.此酶系由 3 种酶和 5 种辅助因子组成,是第三个关键酶催化 的第二次氧化脱羧. 5.琥珀酰 CoA 在琥珀酰硫激酶催化下生成琥珀酸.这是循环中惟一的一次底物水平磷酸化,GDP 磷酸化形成 GTP. 6.琥珀酸在琥珀酸脱氢酶催化下氧化为延胡索酸.这是第三步脱氢,生成 FADH2. 7.延胡索酸在延胡索酸酶作用下水化形成苹果酸. 8.苹果酸在苹果酸脱氢酶催化下氧化为草酰乙酸.这是第四步脱氢,生成 NADH+H+ 一次三羧酸循环过程,可归结为一次底物水平磷酸化,二次脱羧,三个关键酶促反应,四步脱氢氧化反应.每循环一次产生 12 分子 ATP,总反应: 乙酰 CoA+2H2O+3NAD+ +FAD+ADP+Pi→2CO2+3NADH+3H++FADH2+CoASH+ATP (三)能量的估算和生理意义 在体外,1mol 葡萄糖→CO2+H2O,ΔGO'= -2840kJ/mol. 体内总反应:葡萄糖
+6O2+36/38ADP+36/38Pi→6 CO2+42/44H2O+36/38ATP 第一阶段生成 6 或 8 分子 ATP,即 1 分子葡萄糖生成 2 分子丙酮酸,2 分子 ATP,2 分子 NADH+H+(1 分子 NADH+H+在胞液转
运 到线粒体氧化,经不同的转运方式,可生成 2 或 3 分子 ATP) . 第二阶段是 6ATP,即 2 分子丙酮酸氧化脱羧生成 2 分子乙酰 CoA 与 2 分子 NADH+H+ ,后者经电子传递链生成 6ATP. 第三阶段是 24ATP,即 2 分子乙酰 CoA 经三羧酸循环生成 2×12 = 24ATP. 葡萄糖有氧氧化的获能效率 = 38×30.5/2840×100% = 40% 糖的有氧氧化生理意义:①为机体提供更多的能量,是机体利用糖和其他物质氧化而获得能量的最有效方式.②三羧酸循环是糖,脂, 蛋白质三大营养物质最终代谢通路和转化的枢纽.糖转变成脂是最重要的例子.③三羧酸循环在提供某些物质生物合成的前体中起重要作 用. (四)三羧酸循环的 三羧酸循环在细胞代谢中占据中心位置,受到严密的.丙酮酸脱氢酶复合物催化的反应是进入三羧酸循环的必经之路,可通过变 构效应和共价修饰两种方式进行快速调节,乙酰 CoA 及 NADH+H+ 对酶有反馈抑制作用. 三羧酸循环中 3 个不可逆反应是调节部位.关键酶的活性受 ATP,柠檬酸,NADH 的反馈抑制;异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢 酶是主要的调节点,ADP 是异柠檬酸脱氢酶的变构激活剂. 四,乙醛酸循环 在植物和某些微生物存在异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶,勾通了三羧酸循环支路.该途径可以利用乙酰 CoA 生成用于糖异生和其 它生物合成途径中的四碳中间产物.有些微生物具有乙酰 CoA 合成酶,能利用乙酸作为惟一碳源建造自己的机体.乙酸在辅酶 A,ATP 及该酶的参与下活化成乙酰 CoA,而进入乙醛酸循环.油料种子萌发时脂转化为糖就是通过该途径进行的. 五,戊糖磷酸途径 (一)概念和部位 葡萄糖经 G-6-P 生成磷酸戊糖,NADPH 及 CO2 的过程.因从 G-6-P 开始,又称己糖磷酸支路(HMS) .在胞液中进行. 实验证明碘乙酸能抑制甘油醛-3-磷酸脱氢酶,使酵解和有氧氧化途径均停止,但糖的分解仍可进行,在肝脏,脂肪,乳腺,肾上腺皮 质和骨髓等组织,该途径是活跃的. (二)反应过程 1.氧化阶段 从 G-6-P 开始,经过脱氢,脱羧反应生成 5-磷酸核酮糖,2 分子 NADPH+H+及 1 分子 CO2. G-6-P 脱氢酶的活性决定 G-6-P 进入代谢途径的流量,为限速酶.NADPH/NADP+比例升高.反应受抑制;反之,被激活. 2.非氧化阶段 磷酸戊糖分子经过异构化互变,3 种戊糖(5-磷酸核酮糖,5-磷酸核糖,5-磷酸木酮糖)由转酮酶和转醛酶催化,产生 3C,4C,5C, 6C,7C 糖的中间产物,最终生成 6-磷酸果糖和 3-磷酸甘油醛,与糖酵解相连接. 总反应式:6G-6-P+12NADP++7H2O → 5G-6-P+12NADPH+12H++6CO2+Pi (三)生理意义 虽非生物体氧化供能的主要方式,确有两个重要的功能.一是提供 NADPH 用于需要还原力的生物合成反应.二是提供 5-磷酸核糖, 用于核苷酸和核酸的生物合成. 第三节 糖的合成代谢一,蔗糖和淀粉的合成 自然界的糖类起源光合作用,绿色植物的叶绿素,藻类和光合细菌能捕获太阳能用于驱动二氧化碳和水合成糖类.植物的光合作用 包括光反
应和暗反应.光反应产生 ATP 和 NADPH;暗反应亦称固碳反应,通过卡尔文循环将 CO2,NADPH,ATP 合成甘油醛-3-磷酸, 最终产物是蔗糖和淀粉. (一)蔗糖的合成 蔗糖在植物界分布最广,不仅是重要的光合作用产物和高等植物的主要成份,又是糖在植物体中运输的主要形式. 在叶绿体中由卡尔文循环产生的甘油醛-3-磷酸被运送到胞质溶胶用于合成蔗糖.甘油醛-3-磷酸转化为 F-6-P 和 G-1-P(基本是糖酵 解的逆反应) ;随后,G-1-P 转变为 UDP-G,它与 F-6-P 经磷酸蔗糖合成酶催化生成蔗糖-6-磷酸,再由专一的磷酸酯酶脱磷酸形成蔗糖. (二)淀粉的合成 淀粉在叶绿体子座中产生并在子座中以淀粉颗粒储存.合成途径包括由卡尔文循环产生的甘油醛-3-磷酸转变为 G-1-P,再合成核苷酸 的糖衍生物 ADP-G,CDP-G,GDP-G;随后,在引物分子上经转葡糖苷酶催化进行合成直链淀粉,再在 Q 酶作用下生成α-1,6-糖苷键, 形成支链. 二,糖原的合成 葡萄糖等单糖合成糖原的过程称为糖原的合成.糖原合成是在糖原分子(引物约 4-6 个葡萄糖残基)基础上经酶系作用逐个加上葡萄 糖,并形成分支.UDPG 是葡萄糖的活性形式,是参与合成反应的葡萄糖的活性供体. 1.UDP-葡萄糖焦磷酸化酶催化 UTP 和 G-1-P 合成 UDP-G 和焦磷酸,焦磷酸立即被焦磷酸酶水解,释放能量.反应基本上不可逆. 2.糖原合成酶催化形成α-1,4-糖苷键,即把 UDP-G 的糖残基转移到糖原分子非还原端的 C4-OH 基上.此酶是关键酶. 3.分支酶催化α-1,6-糖苷键连接,形成分支.通常分支酶断裂含 7 个葡萄糖残基的一段糖链,将其转移到糖原分子更内部的位点. 总反应式: Gn+G+2ATP → Gn+1+2ADP+2Pi 糖原合成与分解是由不同酶催化的逆向反应,属于不同的途径,有利于调节.糖原合成酶和糖原磷酸化酶是两个过程的关键酶.其活 性均受磷酸化和去磷酸化的共价修饰调节,磷酸化的方式相似,但效果不同,糖原合成酶磷酸化后失活,去磷酸化后有活性,而糖原磷酸 化酶磷酸化后活性变强.两种酶的磷酸化受相应的激酶催化,并通过上一级酶的调节及激素使整个调节过程精细化. 二,糖异生作用 (一)概念和部位 非糖物质(如甘油,丙酮酸,乳酸和生糖氨基酸等)转变为葡萄糖或糖原的过程称为糖异生作用.这是体内单糖生物合成的惟一途径. 肝脏是糖异生的主要器官,长期饥饿时,肾脏的糖异生作用增强.糖异生中许多反应是糖酵解的逆向过程,在胞液和线粒体内发生. (二)反应过程 糖异生并非是糖酵解的逆转,己糖激酶,磷酸果糖激酶,丙酮酸激酶催化的三个高放能反应不可逆,构成\"能障\" ,需要消耗能量走 另外途径,或由其它的酶催化来克服不可逆反应带来的\"能障\" . 1.丙酮酸羧化支路:丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧基化生成草酰乙酸,再经磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶催化脱羧基和磷酸化形成磷酸烯醇 式丙酮酸. 丙酮酸羧化酶仅存在线粒体中,胞液中的丙酮酸必须进入线粒体,才能羧化为草酰乙酸,此步
消耗 1 分子 ATP,草酰乙酸不能直接透 过线粒体膜,转化成苹果酸或天冬氨酸才转运回胞液.PEP 羧激酶在线粒体和胞液都有,此步消耗 1 分子 GTP.PEP 经一系列酶催化生成 F-1,6-BP,其反应需用 1 分子 ATP 和 1 分子 NADH. 2.果糖二磷酸酶催化 F-1,6-BP 水解为 F-6-P. 3.G-6-P 酶催化 G-6-P 水解为葡萄糖. 总反应式:2 丙酮酸
+4ATP+2GTP+2NADH+2H++6H2O → 葡萄糖+4ADP+2GDP+6Pi+2NAD+ 糖异生等于用了 4 分子 ATP 克服由 2 分子丙酮酸形成 2 分子高能磷酸烯醇式丙酮酸的能障,用了 2 分子 ATP 进行磷酸甘油激酶催化 反应的可逆反应.这比酵解净生成的 ATP 多用了 4 分子 ATP. (三)糖异生的和生理意义 糖异生的前体, 例如乳酸是由乳酸脱氢酶催化转化为丙酮酸进入糖异生途径的, 甘油先转变成α-磷酸甘油再转化成磷酸二羟丙酮进入. ATP/AMP 的变化是影响糖异生关键酶活性的重要因素.当 AMP 的水平高时,表明要合成更多的 ATP,AMP 激发 PFK,增加糖酵解 的速率和抑制果糖 1,6-二磷酸酶,关闭糖异生作用;反之,当 ATP 和柠檬酸水平高时,PFK 受抑制,降低酵解的速率,以及柠檬酸激发 果糖 1,6-二磷酸酶,增加糖异生的速率. 糖异生的意义: 1.补充血糖,可保持其浓度的相对恒定.在饥饿或剧烈运动时对保持血糖水平是重要的,在脑和红细胞,几乎完全依靠血糖作为能量 的来源. 2.回收乳酸能量,防止乳酸中毒.剧烈运动时,肌糖原酵解产生大量乳酸,部分由尿排出,但大部分经血液运到肝脏,通过糖异生作 用合成肝糖原和葡萄糖,以补充血糖,再被肌肉利用,形成乳酸循环.所以糖异生途径对乳酸的再利用,肝糖原的更新,补充肌肉消耗的 糖及防止乳酸中毒都有一定的意义. 第六章 脂类代谢教学目标: 教学目标: 1.掌握脂类的结构,生理功能及酶促水解. 2.掌握甘油的氧化,脂肪酸的β-氧化途径;酮体的生成和利用;了解脂肪酸氧化的其他途径. 3.掌握软脂酸合成的部位,原料,途径及关键酶;熟悉脂肪酸链的加长和去饱和;了解脂肪酸代谢的调节. 4.熟悉卵磷脂和脑磷脂的生物合成. 5.熟悉胆固醇合成的部位,原料,过程及其转化. 导入:脂类是人体的重要营养素,分为脂肪和类脂两大类.脂肪的主要功能是储能和供能.类脂包括磷脂,糖脂,胆固醇及其酯,是 生物膜的重要组分,参与细胞识别及信息传递,并是多种生理活性物质的前体.体内脂肪酸的来源有二:一是机体自身合成,以脂肪形式 储存在脂肪组织中,需要时从脂肪动员.饱和脂酸及单不饱和脂酸主要靠机体自身合成.另一来源系膳食的脂肪供给,特别是某些多不饱 和脂酸,动物机体自身不能合成,需从植物油摄取,称为必需脂酸.本章重点讨论脂肪的分解和合成代谢. 第一节一,脂类 概论 脂肪(fat)又称甘油三酯(triglyceride ,TG) .脂肪细胞是哺乳动物脂肪主要储存处.糖原可在短时间(1h 左右)提供用于肌肉收缩的能 量,但持续,剧烈地工作,如马拉松选手竞赛,侯鸟持
久的飞行和蝗虫迁移,其能量来源依赖 TG 的代谢.1g 脂肪氧化释能 37.6 kJ,比等 量的糖或蛋白质高出 2 倍以上. 天然脂肪酸多为偶数 C,16C 或 18C 多见;不饱和脂肪酸中的亚油酸,亚麻酸和花生四烯酸是必需脂肪酸. 磷脂按其化学结构分为甘油磷脂和鞘磷脂. 甘油磷脂是生物膜中含量最多的脂类物质,核心结构是甘油-3-磷酸,C1 和 C2 位的羟基被 2 条脂酰基长链取代(形成疏水尾) ,C3 的 磷酸羟基结合各种取代基形成极性头.包括磷脂酰胆碱(卵磷脂,PC) ,磷脂酰乙醇胺(脑磷脂,PE) ,磷脂酰丝氨酸(PS) ,磷脂酰甘油, 二磷脂酰甘油(心磷脂)及磷脂酰肌醇(PI)六类,每一类又因组成的脂酸不同而有若干种,红细胞就有 100 种以上的不同的磷脂.鞘磷 脂,脑苷脂和神经节苷脂属鞘脂类,在神经组织和脑内含量较高.不含甘油,由一分子脂肪酸,一分子鞘氨醇或其衍生物,一分子极性头 基团组成. 固醇是环戊烷多氢菲的衍生物.胆固醇(cholesterol ,Ch)及胆固醇酯是血浆蛋白和细胞外膜的重要组分.胆固醇可调节生物膜的流动 性,同时也是合成胆汁酸,类固醇激素和维生素 D 等生理活性物质的前体. 二,生物膜 细胞的外周膜和细胞器的内膜系统统称为生物膜.其功能是维持细胞内环境相对稳定的屏障,又是进行物质交换,细胞识别,信息传 递的场所,内膜系统使酶区域化分布保证各种生化反应有序进行.膜的基本结构是脂质双分子层,用\"流体镶嵌模型\"解说. 三,脂类的酶促水解 1.脂肪酶广泛存在于动物,植物和微生物中.在人体内,脂肪的消化主要在小肠,由胰脂肪酶催化,胆汁酸盐和辅脂肪酶的协助使脂 肪逐步水解生成脂肪酸和甘油. 2.磷脂酶有多种,作用于磷脂分子不同部位的酯键.作用于 1 位,2 位酯键的分别称为磷脂酶 A1 及 A2,生成溶血磷脂和游离脂肪酸. 作用于 3 位的称为磷脂酶 C,作用磷酸取代基间酯键的酶称磷脂酶 D.作用溶血磷脂 1 位酯键的酶称磷脂酶 B1. 3.胆固醇酯酶水解胆固醇酯生成胆固醇和脂肪酸. 4.小肠可吸收脂类的水解产物.胆汁酸盐帮助乳化,结合载脂蛋白(apoprotein,apo)形成乳糜微粒经肠粘膜细胞吸收进入血循环.所 以乳糜微粒(chylomicron,CM)是转运外源性脂类(主要是 TG)的脂蛋白. 第二节 脂肪的分解代谢 食物中的脂肪通过消化被脂肪酶逐步降解为甘油和游离脂肪酸 (FFA) ,而储存于脂肪细胞中的脂肪通过脂肪动员降解, 在脂肪动员中, 三酰甘油脂肪酶的活性低,是脂肪动员的限速酶.脂肪分解是生物体利用脂肪作为供能原料的第一个步骤. 一,甘油的氧化 脂肪动员产生的甘油主要在肝细胞经甘油激酶作用生成 3-磷酸甘油, 再脱氢生成磷酸二羟丙酮后循糖代谢途径分解或经糖异生途径转 化成葡萄糖.脂肪细胞及骨骼肌等组织因甘油激酶活性很低,不能很好利用甘油. 二,脂肪酸的氧化分解 脂肪酸不溶于水,在血液中与清蛋白结合后(10:1) ,运送全身各组织,在组织的线粒体内氧化分解,释放大量的能量,以肝脏和肌肉 最
为活跃.1904 年,Knoop 用苯环作标记,追踪脂肪酸在动物体内的转变过程,发现当奇数碳脂肪酸衍生物被降解时,尿中检测出的是马 尿酸,如果是偶数碳,尿中排出的是苯乙尿酸.显然脂肪酸酰基链的降解发生在β-碳原子上,即每次从脂酸链上切下一个二碳单位.以后 的科学实验证明β-氧化学说是正确的,切下的二碳单位是乙酰 CoA,脂肪酸进入线粒体前先被活化. (一)脂肪酸的活化 在胞液中 FFA 通过与 CoA 酯化被激活,催化该反应的酶是脂酰 CoA 合成酶,需 ATP,Mg2+参与.反应产生的 PPi 立即被焦磷酸酶水 解,阻止了逆反应,所以 1 分子 FFA 的活化实际上消耗 2 个高能磷酸键. RCOOH+ATP+CoASH—→RCO~SCoA+AMP+PPi (二)脂酰 CoA 进入线粒体 脂肪酸的氧化是在线粒体内进行的, 而脂酰 CoA 不能自由通过线粒体内膜进入基质, 需耍通过线粒体内膜上肉毒碱转运才能将脂酰基 带入线粒体.内膜两侧的脂酰 CoA 肉毒碱酰基转移酶Ⅰ,Ⅱ(同工酶)催化完成脂酰基的转运和肉毒碱的释放.酶Ⅰ是 FFA 氧化分解的 主要限速酶. (三)脂酰 CoA 的β-氧化 脂酰 CoA 氧化生成乙酰 CoA 涉及四个基本反应:第一次氧化反应,水化反应,第二次氧化反应和硫解反应. 第一步由脂酰 CoA 脱氢酶催化脱氢生成反-⊿2-烯脂酰 CoA 和 FADH2. 第二步由反-⊿2-烯脂酰 CoA 水化酶催化加水生成 L-(+)-β-羟脂酰 CoA. 第三步由 L-(+)-β-羟脂酰 CoA 脱氢酶催化生成β-酮脂酰 CoA 和 NADH+H+. 第四步由硫解酶作用底物的α-与β-C 间断裂,CoASH 参与,生成 1 分子乙酰 CoA 和比原来少 2 个 C 的脂酰 CoA.然后再一轮β氧化,如此循环反应. (四)脂肪酸氧化的能量计算 1 分子软脂酸 (16C) 7 次β-氧化可生成 8 个乙酰 CoA, 个 NADH+H+, 个 FADH2. 经 7 7 每个乙酰 CoA 进入 TCA 循环生成 3 个 NADH+H+, 1 个 FADH2,1 个 GTP,并释放 2 分子 CO2. 总反应方程式是:软脂酰 CoA+23 O2+131Pi+131ADP→CoASH+16 CO2+123H2O+131ATP 净生成的 ATP 数:12×8+3×7+2×7-2 =129. (脂肪酸活化消耗 2 个高能磷酸键,相当消耗 2 个 ATP) 当以脂肪为能源时,生物体还获得大量的水.骆驼的驼峰是储存脂的\"仓库\" ,既提供能量,又提供所需的水. (五)脂肪酸氧化的其他途径 1. 奇数碳原子脂酸的氧化 人体含极少量奇数碳脂肪酸,而许多植物,海洋生物,石油酵母等含一定量的奇数碳脂肪酸.其β-氧化除生成乙酰 CoA 外,还生成 1 分子丙酰 CoA,后者可通过β-羧化酶及异构酶的作用生成琥珀酰 CoA,经 TCA 途径彻底氧化. 2. 不饱和脂肪酸的氧化 机体中脂酸约一半以上是不饱和脂肪酸,其中的双键均为顺式(cis)构型,不能被烯脂酰 CoA 水化酶作用(该酶催化的是反式构型 双键的加水) ,所以需要异构酶和还原酶才能使一般不饱和脂肪酸的氧化进行下去.如油酸是十八碳一烯酸(cis-⊿9) ,细胞质中的油酸同 样先活化生成油酰 CoA,经转运系统换成线粒体基质中的油酰 CoA,经三轮
β-氧化生成 3 分子乙酰 CoA 和 cis-⊿3-十二碳烯脂酰 CoA, 后者经异构酶催化为 trans-⊿2-十二碳烯脂酰 CoA,就可由烯脂酰 CoA 水化酶作用生成 L-β-羟脂酰 CoA,再经五轮β-氧化生成 6 分子乙 酰 CoA,总计 9 分子乙酰 CoA. 多不饱和脂肪酸的氧化还需一个特殊的还原酶. 三,酮体的生成和利用 脂肪酸经β-氧化生成的大多数乙酰 CoA 进入 TCA 循环, 当乙酰 CoA 的量超过 TCA 循环氧化能力时, 多余的生成酮体 (ketone bodies) , 包括β-羟丁酸(占 70%) ,乙酰乙酸(占 30%)和丙酮(微量) .酮体是燃料分子,作为\"水溶性的脂\" ,在心脏和肾脏中比脂肪酸氧化得 更快. (一)酮体是在肝脏中合成的 2 分子乙酰 CoA 经肝细胞线粒体乙酰乙酰 CoA 硫解酶催化缩合成乙酰乙酰 CoA,再在羟甲基戊二酸单酰 CoA 合成酶(HMG- CoA 合 成酶)的催化下,结合第三个乙酰 CoA 生成β-羟基-β-甲基戊二酸单酰 CoA.然后 HMG- CoA 裂解酶催化生成乙酰乙酸和乙酰 CoA. (乙 酰乙酰 CoA 也可在硫酯酶催化下水解为乙酰乙酸和 CoA) 乙酰乙酸在β-羟丁酸脱氢酶的催化下,由 NADH 供氢,被还原为β-羟丁酸或脱羧生成丙酮. (二)酮体的利用 酮体是正常的,有用的代谢物,是很多组织的重要能源.但肝细胞氧化酮体的酶活性很低,因此酮体经血液运输到肝外组织进一步氧 化分解.心,肾,脑和骨胳肌线粒体有活性很高的氧化酮体的酶.β-羟丁酸在β-羟丁酸脱氢酶催化下重新脱氢生成乙酰乙酸,在不同肝 外组织中乙酰乙酸可在琥珀酰 CoA 转硫酶或乙酰乙酸硫激酶作用下转变为乙酰乙酰 CoA,再由乙酰乙酰 CoA 硫解酶裂解为 2 分子乙酰 CoA,进入 TCA 途径彻底氧化. 脑在正常代谢时主要以葡萄糖为能源,但在饥饿和患糖尿病时,也不得不利用乙酰乙酸,长期饥饿时,脑需要的燃料有 75%是乙酰乙 酸.长期饥饿和糖尿病患者的呼吸中会拌有丙酮的气味(乙酰乙酸脱羧形成) . 正常情况下,血中酮体含量很低,为 0.05~0.5mmol/L.在饥饿,高脂低糖膳食和糖尿病时,脂肪动员加强,酮体生成增加,超出肝外 组织利用酮体的能力,血中酮体含量升高,造成酮症酸中毒,称为酮血症,若尿中酮体增多则称为酮尿症. 第三节脏合成能力最强. 脂肪的合成代谢 人体内的脂肪来源于食物和体内合成,原料涉及 3-磷酸甘油的生成和脂肪酸的生物合成.肝脏,脂肪组织和小肠均可合成脂肪,以肝 一,3-磷酸甘油的生成 糖分解代谢产生的磷酸二羟丙酮经脱氢酶催化还原生成 3-磷酸甘油是最主要的来源;脂肪分解产生的甘油主要用于糖异生,很少一部 分经脂肪组织外的甘油激酶催化与 ATP 作用生成 3-磷酸甘油. 二,脂肪酸的生物合成 合成脂肪酸的酶系主要在胞浆,而糖代谢提供的乙酰 CoA 原料又在线粒体生成,所以乙酰 CoA 需通过转运.合成脂肪酸的过程不同 于β-氧化的逆过程,是由 7 种酶蛋白和酰基载体蛋白(ACP)组成的多酶复合体完成,合成的产物是软脂酸.碳链延长是在线粒体和内质
网中的 2 个不同的酶系催化下进行的. (一)软脂酸的生物合成 1. 乙酰 CoA 转运至胞浆(柠檬酸-丙酮酸循环) . 乙酰 CoA 与草酰乙酸在线粒体先缩合生成柠檬酸,经内膜上的载体转运入胞浆,在 ATP-柠檬酸裂解酶作用下生成乙酰 CoA 与草酰乙 酸,前者参与脂肪酸的合成,后者可经苹果酸脱氢酶和苹果酸酶催化转变为丙酮酸再进入线粒体,也可在载体作用下,经苹果酸直接进入 线粒体,继而转变为草酰乙酸. 2. 乙酰 CoA 羧化生成丙二酸单酰 CoA 乙酰 CoA 羧化酶催化,ATP,生物素,Mg2+参与,总反应: 乙酰 CoA+ATP+HCO3-——→ 此酶的活性. 3. 乙酰基和丙二酸单酰基的转移(负载) 丙二酸单酰 CoA+ADP+Pi ATP 提供能量,生物素起转移羧基的作用,乙酰 CoA 羧化酶是 FA 合成的限速酶(变构酶) ,变构剂柠檬酸与其变构部位结合可激活 脂肪酸合成的酰基载体不是 CoA,而是酰基载体蛋白.在乙酰 CoA-ACP 转酰基酶和丙二酸单酰 CoA-ACP 转酰基酶的催化下,乙酰 基和丙二酸单酰基被转移至 ACP 上,生成乙酰-ACP 和丙二酸单酰-ACP. 4. 脂肪酸合成酶系催化进行缩合,还原,脱水,还原反应. (1)酮酰基-ACP 合成酶接受乙酰-ACP 的乙酰基,释放 HS-ACP,并催化乙酰基转移到丙二酸单酰-ACP 上生成乙酰乙酰-ACP. (2)乙酰乙酰-ACP 中的β-酮基转换为醇,生成β-羟丁酰-ACP.反应由酮酰基-ACP 还原酶催化,NADPH 为酶的辅酶. (3)β-羟丁酰-ACP 经脱水酶催化生成带双键的反式丁烯酰-ACP. (4)反式丁烯酰-ACP 还原为四碳的丁酰-ACP.反应是由烯脂酰-ACP 还原酶催化, NADPH 为酶的辅酶. 如此每循环一次,有一个新的丙二酸单酰 CoA 参与合成(贡献二碳单位) 次循环,生成 16C 的软脂酰-ACP,经硫解酶水解生成软 ,7 脂酸和 HS-ACP. 哺乳动物脂肪酸氧化和合成的主要区别? (二)脂肪酸碳链的延长 植物和动物中脂肪酸合成酶的最常见的产物是软脂酸.其它各种 FA 的合成需要肝细胞的线粒体或内质网中的一些酶. 在线粒体,乙酰 CoA 提供碳源,NADPH 提供还原当量,循β-氧化逆过程,前 3 步反应相同,第 4 步反应由烯脂酰 CoA 还原酶催化, 辅酶是 NADPH 而不是 FAD,通过这种方式,每一轮可延长 2 个 C,一般可延长碳链至 24 或 26C,以 18C 的硬脂酸为主. 在内质网,丙二酸单酰 CoA 提供碳源,NADPH 供氢,反应过程与软脂酸合成相似,不同的是 CoASH 代替 ACP 作为酰基载体,一般 可延长碳链至 22 或 24C,也以 18C 的硬脂酸为主. (三)不饱和脂肪酸的合成 动物细胞含有催化不饱和 FA 双键形成的去饱和酶,可催化远离 FA 羧基端的第九个碳的去饱和.但九碳以上的去饱和则只有植物中 的去饱和酶能催化.如亚油酸(18:2 ⊿9,12) ,亚麻酸(18:3⊿9 ,12 ,15) ,花生四烯酸
(20:4⊿5 ,8 ,11,14)是动物所需的,但动物不 能合成,是必须由食物供给的必需脂肪酸.当人体缺乏必需脂肪酸时,会出现生长缓慢,抵抗力下降,皮肤炎和毛发稀疏等症状.亚麻酸 和
花生四烯酸只能从亚油酸转化生成,花生四烯酸又是合成前列腺素(PG)及血栓素等重要生理活性物质的前体. (四)脂肪酸代谢的 动物的 FA 代谢受激素的,主要调节物是胰岛素,肾上腺素和胰高血糖素的作用与胰岛素相反. 三,脂肪的合成 细胞内的 FFA 的含量并不多,大多数是以酯化形式三脂酰甘油和磷脂存在. 脂肪合成的前体是甘油-3-磷酸和脂酰 CoA.酰基转移酶催化 1 分子甘油-3-磷酸和 2 分子脂酰 CoA 生成磷脂酸,经磷脂酸磷酸酶水解 去磷酸生成二脂酰甘油,再由酰基转移酶催化结合 1 分子脂酰 CoA 生成三脂酰甘油. 第四节 磷脂的生物合成 哺乳动物的所有组织均可合成磷脂.CTP 在磷脂合成中特别重要. 一,甘油磷脂的合成 在生理 pH 下,磷脂酰胆碱与磷脂酰乙醇胺所带的净电荷为零,属于中性磷脂,而磷脂酰肌醇与磷脂酰丝氨酸带有负的净电荷属于酸 性磷脂. 磷脂酰胆碱,磷脂酰乙醇胺和三脂酰甘油是通过一个共有途径合成的. 先由甘油-3-磷酸作为酰化反应的骨架与提供酰基的脂酰 CoA 反应生成磷脂酸,脱磷酸后成二脂酰甘油(DG) .DG 直接酰化形成 TG 或与 CDP-胆碱或 CDP-乙醇胺反应生成磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺.DG 是合成的重要中间物. CDP-胆碱与 CDP-乙醇胺是胆碱与乙醇胺在激酶的催化下先生成磷酸胆碱和磷酸乙醇胺,再在转移酶作用下,与 CTP 反应生成. 磷脂酰乙醇胺可接受 S-腺苷蛋氨酸提供的-CH3 而转化成磷脂酰胆碱. 磷脂酸是两个酸性磷脂合成的直接前体.磷脂酸与 CTP 反应生成 CDP-二脂酰甘油.在 E.coli,CDP-二脂酰甘油与丝氨酸结合生成磷 脂酰丝氨酸;在原核生物和真核生物中,与肌醇结合形成磷脂酰肌醇,或与 1 分子磷脂酰甘油结合生成心磷脂,心磷脂是心肌线粒体内膜 的主要磷脂. 在哺乳动物中,磷脂酰丝氨酸是在碱基交换酶的作用下形成的.该酶催化丝氨酸取代磷脂酰乙醇胺中的乙醇胺,反应是可逆的. 二,鞘脂的合成 鞘脂是一类以鞘氨醇为结构骨架的脂,骨架是由软脂酰 CoA 及丝氨酸为原料合成.鞘氨醇酰化生成 N-脂酰鞘氨醇(神经酰胺) ,再与 CDP-胆碱或磷脂酰胆碱形成鞘磷脂,也可与 UDP-半乳糖反应生成脑苷脂. 第五节 胆固醇的生物合成 机体所需胆固醇主要通过自身合成,仅从食物(内脏,蛋黄,肉类等)摄取少量. 一,合成部位和原料 除脑组织和成熟红细胞外,几乎全身各组织均可合成胆固醇,肝脏的合成能力最强,占总量的 3/4 以上. 乙酰 CoA 是起始原料,需 ATP 供能和 NADPH 供氢.合成酶系存在于胞液和内质网. 二,合成的基本过程 合成过程复杂,有近 30 步酶促反应,大致分为三个阶段: 乙酰基(C2)→异戊二烯(C5)→鲨烯(C30)→胆固醇(C27) 1.乙酰 CoA 合成异戊烯焦磷酸(IPP) 2 分子乙酰 CoA 经硫解酶催化缩合成乙酰乙酰 CoA,由 HMG- CoA 合成酶催化结合 1 分子乙酰 CoA,生成β-羟基-β-甲基戊二酸单 酰 CoA(HMG- CoA) HMG- CoA 还原酶(限速酶)催化其生成甲羟戊酸(MVA) , ,
消耗 2 分子 NADPH.甲羟戊酸经磷酸化,脱羧三 步酶促反应生成活泼的异戊烯焦磷酸(IPP) . 2.鲨烯的合成 一种异构酶催化异戊烯焦磷酸转换成二甲烯丙基焦磷酸(DPP) .然后它按照头对尾方式与另一分子异戊烯焦磷酸缩合成 10C 牛龙 牛儿焦磷酸.再按头对尾方式与另一分子异戊烯焦磷酸缩合成 15C 焦磷酸法尼酯(FPP) 分子 FPP 由鲨烯合成酶催化,仍然按头对尾方 ,2 式缩合成 30C 的鲨烯. 3.鲨烯转换为胆固醇 鲨烯转换为胆固醇的过程很复杂,一个中间产物是羊毛固醇,涉及加氧,环化,形成由四个环组成的胆固醇核的反应.而由羊毛固醇 到胆固醇还要经过甲基的转移,氧化,脱羧等约 20 步反应. 三,胆固醇合成的调节和转变 调节胆固醇合成的关键酶是 HMG- CoA 还原酶. 该酶受胆固醇的抑制, 同时酶的磷酸化也可调节酶的活性. 对于严重的高胆固醇血症, 常使用 HMG- CoA 还原酶的抑制剂,如洛伐他汀. 胆固醇的母核是环戊烷多氢菲,在体内不能被降解,但可以转变成许多具有重要生理功能的固醇类物质. 1.胆汁酸:3/4 的胆固醇可在肝脏转变为胆汁酸,随胆汁入肠道,参与脂类的消化吸收.这是胆固醇代谢的主要去路. 2.类固醇激素:胆固醇在肾上腺皮质球状带可转变为肾上腺皮质激素,调节糖,脂,蛋白质代谢;在肾上腺皮质网状带可转变雄激素 及少量的雌激素;在睾丸和卵巢组织可经睾酮再转变成二氢睾酮或雌二醇后发挥生理作用. 3.VD3:胆固醇在肠粘膜细胞内可转变为 7-脱氢胆固醇(VD3 原) ,经血液运输到皮肤,在紫外线照射下转变成 VD3,继而在肝,肾 进行两次羟化生成 1,25-( O H )2 -D3,调节钙磷代谢. 4.胆固醇酯:在肝,肾上腺皮质和小肠等组织中,胆固醇与脂酰 CoA 在脂酰 CoA 胆固醇酰基转移酶(ACAT)作用下,生成胆固醇酯. (胆固醇酯酶可将其水解为胆固醇. ) 在血浆中,胆固醇在卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)作用下,接受卵磷脂分子中的脂酰基生成胆固醇酯. 小部分胆固醇可经肠道细菌作用后经肠道排出. 第七章 氨基酸代谢教学目标: 教学目标: 1.熟悉蛋白质的酶促降解过程. 2.掌握氨基酸分解代谢的一般规律(脱氨基和脱羧基作用,氨基酸分解产物氨和α- 酮酸的去路,尿素的合成) . 3.掌握氨基酸合成途径的类型,必需氨基酸和一碳单位概念;了解某些重要生物活性物质的合成. 导入:蛋白质是生命的物质基础,也是能源物质.蛋白质在体内首先分解为氨基酸而后再进一步代谢,所以氨基酸代谢是蛋白质分解 代谢的中心内容.本章重点讲述氨基酸分解代谢.蛋白质的合成另立一章. 第一节 蛋白质的酶促降解一,蛋白质的营养价值 蛋白质是重要的营养素,人和动物摄食蛋白质用以维持细胞,组织的生长,更新和修补;产生酶,激素,抗体和神经递质等多种重要 的生理活性物质,这是糖和脂类不可替代的.每克蛋白质在体内氧气分解产生 4 千卡能量. 植物和大多数细菌能够合成全部 20 种基本氨基酸.然而哺乳类不能全部合成.对于成人来说,缬氨酸,
亮氨酸,异亮氨酸,苏氨酸, 甲硫氨酸,赖氨酸,苯丙氨酸和色氨酸必须由食物供应,称为营养必需氨基酸,对婴幼儿,组氨酸和精氨酸不能满足营养需要量.可由生 物机体合成的氨基酸称为非必需氨基酸. 蛋白质的营养价值取决于所含氨基酸的种类,数量及其比例,如果某种食物蛋白中必需氨基酸的种类和比例与人体组织蛋白接近,其 营养价值就高.营养价值较低的蛋白质混合食用,可使必需氨基酸相互补充提高其营养价值,这称为蛋白质的互补作用. 蛋白质的生理需要量根据氮平衡实验,我国营养学会推荐成人每日需要量为 80 克. 二,蛋白质的酶促降解 蛋白质大分子难以通透生物膜吸收,有时有些抗原,毒素可少量通过粘膜细胞吞饮进入体内而引起过敏,毒性反应.食物蛋白必需经 过消化,水解成氨基酸才被机体利用.消化自胃中开始,主要在小肠进行. 蛋白水解酶又称肽酶,包括内肽酶,外肽酶,寡肽酶和二肽酶.内肽酶有胃蛋白酶,胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶,对肽链 内肽键的特异性不同.胃蛋白酶对底物特异性较低,主要水解 Phe,Try C 端的肽键;胰蛋白酶水解 Lys,Arg C 端;胰凝乳蛋白酶作用 Phe, Try C 端;弹性蛋白酶作用脂肪族氨基酸 C 端.羧肽酶,氨肽酶是外肽酶,羧肽酶 B 要求肽的 C 末端氨基酸残基必须是 Arg,Lys;羧肽酶 A 则水解除 Arg,Lys,Pro 或羟脯氨酸外的 C 末端氨基酸残基. 胃粘膜主细胞分泌胃蛋白酶原(pepsinogen) ,经胃酸激活生成胃蛋白酶.胃蛋白酶有自身激活作用.胰酶的前体也是无活性的酶原, 进入十二指肠后,胰蛋白酶原迅速被肠激酶激活;胰蛋白酶自身激活作用不强,加上胰液中存在的胰蛋白酶抑制剂,可保护胰脏免遭自身 消化,但胰蛋白酶能迅速激活胰液中其他几种酶原. 组织蛋白酶不同于消化道中的蛋白酶.动物死后,组织自溶和尸体腐烂与它有关.植物的种子,幼苗,叶和果实都含有蛋白酶,种子 萌发时,蛋白酶的活力最强.某些微生物在适当的条件下能产生大量的细胞外蛋白酶,利用工业发酵可生产蛋白酶. 氨基酸的吸收主要在小肠,是一个耗能的主动吸收过程.外源性氨基酸和内源性氨基酸混合,共同组成氨基酸代谢库,其去路大部分 用以合成组织蛋白质. 氨基酸的一般代谢 第二节 氨基酸的一般代谢氨基酸的一般代谢是指各种氨基酸共同的分解代谢途径.开始于脱氨作用;氨与天冬氨酸的 N 原子结合,形成尿素并被排放;氨基酸 的碳骨架(脱氨基产生的α-酮酸)转化为一般的代谢中间物. 一,脱氨基作用 氨基酸脱氨有氧化脱氨和非氧化脱氨两种方式,氧化脱氨又和转氨作用组成联合脱氨基作用.非氧化脱氨主要在微生物体内进行. 1.氧化脱氨基作用 氧化脱氨是酶催化下伴随有脱氢的脱氨, α-氨基酸转变为α-酮酸. 主要的酶有 L-氨基酸氧化酶, D-氨基酸氧化酶和 L-谷氨酸脱氢酶. 前二类是黄素蛋白酶,辅基为 FMN 和或 FAD,在动物体内作用都不大,所形成的 FMNH2 或 FADH2 被氧分子氧化,产生毒性的过氧化 氢,
可由过氧化氢酶分解为水和氧. L-谷氨酸脱氢酶广泛分布于动物,植物和微生物,辅酶为 NAD+或 NADP+.L-谷氨酸脱氢酶活性高,专一性强,只催化 L-谷氨酸氧 化脱氨生成α-酮戊二酸,NH3,NADH 或 NADPH,反应是可逆的.此酶是一种变构酶,ATP,GTP 和 NADH 是变构抑制剂,而 ADP, GDP 是变构激活剂. 味精生产即利用微生物体内的 L-谷氨酸脱氢酶将α-酮戊二酸转变为谷氨酸,进而转化为谷氨酸钠. 2.转氨基作用 一种α-氨基酸的氨基在转氨酶催化下转移到α-酮酸上,生成相应的α-酮酸和另一α-氨基酸,反应是可逆的. 转氨作用沟通了糖与蛋白质的代谢. 大多数转氨酶以α-酮戊二酸作为氨基的受体, 这样许多氨基酸的氨基通过转氨作用转化为谷氨酸, 再经 L-谷氨酸脱氢酶的催化使氨基酸氧化分解.所以谷氨酸在很多氨基酸合成和降解代谢反应中是一个关键的中间代谢物. 已发现 50 种以上转氨酶.谷丙转氨酶(GPT)在肝脏中活性最高,谷草转氨酶(GOT)在心脏中活性最高,都是细胞内酶.肝细胞 受损,血清 GPT 明显升高. 而心肌梗死患者 GOT 显著上升. 转氨酶的辅酶只有一种,即磷酸吡哆醛,是 VB6 的磷酸酯.在转氨过程中,磷酸吡哆醛及磷酸吡哆胺之间相互转变,起着传递氨基 的作用,类似于打乒乓球,所以称为乒-乓反应机制. 3.联合脱氨基作用 两种或两种以上的酶联合催化氨基酸的α-氨基脱下,并产生游离氨的过程,称为联合脱氨基作用.动物体内大部分氨基酸是通过这种 方式脱氨的,常见的有两种途径: (1)转氨酶与 L-谷氨酸脱氢酶的联合 主要在肝,肾等组织,转氨酶与 L-谷氨酸脱氢酶的联合作用,可使大部分氨基酸脱去氨基,全过程是可逆的,其逆过程可以合成新的 氨基酸.在这一过程中,α-酮戊二酸是一种氨基传递体,可由三羧酸循环中大量产生. (2)连续转氨偶联嘌呤核苷酸循环 主要在心肌,骨骼肌和脑进行.活动的肌肉会生氨是因为肌肉内 L-谷氨酸脱氢酶活性不高,氨基酸通过连续脱氨,将氨基转移给草酰 乙酸,生成天冬氨酸,再与次黄嘌呤核苷酸(IMP)生成 AMP.AMP 在腺苷酸脱氢酶催化下,生成 IMP 并释放氨,完成联合脱氨基作用. IMP 既是接受天冬氨酸的起始物,又是释放氨基后的再生物,于是构成了嘌呤核苷酸循环. 二,氨的去路 1.氨对动物是有毒的 氨在 pH7.4 时主要以 NH4+的形式存在,在兔体内,血氨达到 5mg/100mL,兔即死亡,正常人血氨浓度小于 60μmol/L,血氨升高会引 起脑功能紊乱,出现中毒症状,是肝昏迷发病的重要机制之一. 血氨的去路:①合成尿素(人体 80%～90%的氨以尿素形式排出,鸟类和生活在比较干燥环境中的爬虫类以尿酸形式排出,水生动物 可直接排出) ;②合成谷氨酰胺(这是神经组织解氨毒的重要方式,也是氨的储存,运输方式.在植物体内,氨的运输,储存和利用形式 是天冬酰胺) ;③合成非必需氨基酸或其他含氮物(嘌呤或嘧啶碱) . 2.尿素的合成 (1)部位:肝脏线粒体和胞液. (2)机理:1932 年,德国学者 Krebs 和
Hensleit 根据实验研究,提出了鸟氨酸循环(ornithine cycle)合成尿素的学说,这比三羧酸 循环发现早 5 年.实验的根据是:将鼠肝切片置于胺盐和重碳酸盐介质中,有氧条件下保温数小时,发现胺盐含量减少,而尿素增多.当 加入少量鸟氨酸,瓜氨酸或精氨酸能大大加速尿素的合成.肝脏又含有精氨酸酶,可催化精氨酸水解生成鸟氨酸和尿素.于是一个循环机 制就出现. (3)反应过程:有 5 步反应,前 2 步在肝细胞线粒体,其他 3 步在胞质溶液中进行.尿素循环本身是四步酶促反应组成. 氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ(CPS-Ⅰ)激活氨结合 CO2 形成氨甲酰磷酸. 鸟氨酸转氨甲酰酶催化氨甲酰磷酸转移到鸟氨酸上生成瓜氨酸. 精氨琥珀酸合成酶催化瓜氨酸与天冬氨酸缩合生成精氨琥珀酸.这是尿素中第 2 个氮原子的来源. 精氨琥珀酸酶催化精氨琥珀酸裂解为精氨酸和延胡索酸(后者可进入三羧酸循环,并转变为草酰乙酸,转氨后又形成天冬氨酸) . 精氨酸酶水解精氨酸生成尿素,并重新产生鸟氨酸,进入第二轮循环. 总反应式:NH3 + HCO3- +天冬氨酸 +3ATP → CO( N H 2)2 + 延胡索酸 + 2ADP+2Pi+AMP+PPi 尿素的合成是一个耗能的过程,循环中使用了 4 个高能磷酸键(3 分子 ATP 水解为 2ADP 及 Pi,一个 AMP 和 PPi,后者随之水解为 Pi) . 尿素循环产生的延胡索酸可进入 TCA,精氨酸与甘氨酸缩合形成瓜基乙酸,进而合成肌酸磷酸(肌肉中的一种高能仓库) . (4)调节:氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ是变构酶,乙酰谷氨酸(AGA)是该酶的激活剂,而精氨酸又是 AGA 合成酶的激活剂,因此,精氨 酸浓度增高时,尿素生成加速.精氨琥珀酸合成酶活性最低,是限速酶. 三,α-酮酸的去路 α-酮酸的去路:①氨基化生成非必需氨基酸(如丙氨酸,谷氨酸和天冬氨酸由一步转氨反应合成,其它的也是通过短的,不太耗能的 途径合成) ;②转变成糖和脂肪;③氧化供能. 脊椎动物体内的 20 种氨基酸的碳骨架由各自的酶系进行氧化分解,途径各异,但集中形成 5 种产物进入柠檬酸循环.这 5 种产物是 乙酰 CoA,α-酮戊二酸,琥珀酰 CoA,延胡索酸和草酰乙酸.它们最后氧化成 CO2 和 H2O,释放能量. 降解为柠檬酸循环中间代谢物的氨基酸还可以进入糖异生途径生成葡萄糖,这样的氨基酸称为生糖氨基酸;那些形成乙酰 CoA 氨基 酸可以成为脂肪酸和酮体的前体,称生酮氨基酸;既可生成柠檬酸循环中间代谢物,又可生成乙酰 CoA 的氨基酸称为生糖兼生酮氨基酸. 氨基酸碳骨架进入 TCA 的途径如下图. 第三节 氨基酸合成代谢的概况一,氨基酸的 N 原子及碳骨架的来源 不同的生物合成氨基酸的能力不同,合成氨基酸的种类也有差异.只有少数生物(能合成固氮酶的微生物和藻类)可以利用 N2 和简单 的碳化合物合成氨基酸.氨可以被所有生物所利用,由 N2 衍生的氨通过谷氨酸和谷氨酰胺整合到氨基酸等代谢物中,它们的碳骨架来自 糖酵解,柠檬酸循环和戊糖磷酸途径. 氨基酸生物合成途径不是分解途径
的逆转,是多酶体系催化的多步骤反应.所有自身能合成的非必需氨基酸都是生糖氨基酸.而必需 氨基酸有生糖和生酮氨基酸,因为它们转变成糖和转变成酮体的过程是不可逆的,所以脂肪很少或不能用来合成氨基酸. 不同氨基酸的生物合成途径不同,按相关代谢途径的中间物提供的起始物的不同分为六个类型: 二,氨基酸与一碳单位 生物体内许多物质的代谢和含有一个碳原子的基团有关,如卵磷脂的生物合成中有由 S-腺苷甲硫氨酸提供甲基的反应.某些氨基酸在 分解代谢过程中可以产生一碳单位. 1.概念:甲基,亚甲基(-CH2-) ,次甲基(-CH=) ,甲酰基,亚胺甲基(-CH=NH)等,称为一碳单位.但 CO2 不属于这种类型. 2.产生和转运:一碳单位主要来源于丝氨酸,甘氨酸,组氨酸及色氨酸的代谢.一碳单位不能游离存在,必须与载体四氢叶酸(FH4 或 THFA)结合转运和参与代谢.叶酸为 B 族维生素,在体内经二氢叶酸还原酶作用,加氢形成 FH4.一碳单位通常结合在 FH4 分子的 N5,N10 位上,如 N5,N10 -甲烯四氢叶酸. 丝氨酸在羟甲基转移酶催化下,生成甘氨酸的过程中产生
N5,N10–CH2-FH4,而甘氨酸在甘氨酸裂解酶作用下,也会产生 N5,N10 –CH2-FH4. 组氨酸在体内经酶促分解产生 N-亚氨甲基谷氨酸,进而转化为谷氨酸. (FH4 接受亚氨甲基生成 N5-CH=NH-FH4,再生成 N5, N10=CH-FH4,后者可参与合成嘌呤碱 C8 原子. ) 色氨酸在分解过程中产生甲酸,结合 FH4,生成 N10-甲酰四氢叶酸,参与合成嘌呤碱 C2 原子. 不同形式的一碳单位可通过氧化还原反应而彼此转变.其中 N5-甲基四氢叶酸的生成是不可逆的,它的含量较多,成为细胞内四氢叶 酸的储存形式和甲基的间接供体,即将甲基转移给同型半胱氨酸生成甲硫氨酸(Met) ,在腺苷转移酶催化下生成 S-腺苷甲硫氨酸(SAM) , 再在甲基转移酶催化下,将活性甲基转移给甲基受体,然后水解去除腺苷生成同型半胱氨酸,从 Met 活化为 SAM 到供出甲基及其再生成 的整个过程称为甲硫氨酸循环.体内一些有重要生理功能的化合物,如肾上腺素,胆碱,肉碱,肌酸等的合成都是从 SAM 获得活性甲基. 3.生理功用:主要是作为合成嘌呤和嘧啶核苷酸的原料.是将氨基酸和核苷酸代谢联系起来,与细胞的增殖,生长和机体发育过程有 密切关系. 一, 一些氨基酸衍生物的合成 氨基酸除了作为蛋白质的构件分子外,还是许多特殊生物分子的前体,包括激素,辅酶,核苷酸,卟啉,NO 及一些胺类分子.以下 仅介绍几种: 1.神经递质和激素 氨基酸的脱羧作用在微生物中很普遍,在高等植物组织中亦有,但不是机体氨基酸代谢的主要方式.体内部分氨基酸可在专一性很高 的氨基酸脱羧酶的催化下,生成相应的胺.如在脑组织,谷氨酸在谷氨酸脱羧酶作用下,脱去α-羧基生成γ-氨基丁酸(GABA) ,是一种 抑制性神经递质. 组氨酸脱羧生成的组胺可控制血管收缩以及胃分泌胃酸. 色氨酸经羟化后脱羧生成 5-羟色胺(5-HT) ,也是一种神经递质,
还是某些非神经组织的激素. 苯丙氨酸和酪氨酸是两种重要的芳香族氨基酸.苯丙氨酸经羟化作用生成酪氨酸.后者参与儿茶酚胺,黑色素等代谢.苯酮酸尿症, 白化病等遗传病与它们代谢异常有关. 2.牛磺酸 牛磺酸是某些胆酸的组分,于 1827 年在牛的胆汁中发现.牛磺酸分布于心,肝,肾,肺,脑,骨骼肌,来源于半胱氨酸氧化脱羧, 也被认为是一种抑制性神经递质. 第八章 核苷酸代谢教学目标: 教学目标: 1.熟悉核酸的酶促降解(核酸酶的种类,嘌呤和嘧啶的分解及代谢终产物) . 2.掌握核苷酸生物合成的基本途径及特点(嘌呤核苷酸从头合成的原料,途径,产物,调节和抗代谢物;嘧啶核苷酸从头合成的原料, 途径,产物,调节和抗代谢物) . 3.了解核苷酸合成的补救途径和脱氧核苷酸的合成. 导入:核苷酸是核酸的基本结构单位,具有多种重要的生理功能.人体内的核苷酸主要由机体细胞自身合成.因此,一般不作为营养 必需物质.食物中的核酸多以核蛋白的形式存在,受胃酸作用,分解成核酸与蛋白质;核酸经胰液和肠液各种水解酶的作用逐步水解,食 物来源的嘌呤和嘧啶极少被机体利用.本章重点讨论核苷酸在体内的合成. 第一节 核酸的酶促降解 一,核酸酶类 动物可以分泌水解酶类来分解食物中的核蛋白和核酸类物质,植物一般不能消化体外的有机物质.但所有生物细胞都含有与核酸代谢 有关的酶类. 核酸酶作用核酸链的磷酸二酯键产生寡聚核苷酸和单核苷酸.按作用底物分为核糖核酸酶(RNase)和脱氧核糖核酸酶(DNase) ;按 作用部位有核酸内切酶和核酸外切酶; 在细菌中存在一类能识别并水解外源 DNA 的核酸内切酶, 称作性内切酶, 可用于特异切割 DNA, 是很有用的工具酶.核酸的分解过程如下: 核酸 → 核苷酸 → 核苷+磷酸 →嘌呤碱和嘧啶碱+戊糖-1-磷酸 核苷酸酶(磷酸单脂酶)水解核苷酸生成核苷和磷酸. 分解核苷的酶有两类:核苷磷酸化酶将核苷和磷酸转化成游离碱基和戊糖-1-磷酸,反应是可逆的,此酶存在广泛.核苷水解酶主要在 植物和微生物体内,只对核糖核苷水解,生成碱基和戊糖. 二,嘌呤碱的分解 1.不同种类的生物分解嘌呤碱的能力不同,因而代谢终产物不同. 人,猿,鸟类和某些爬虫类和昆虫以尿酸作为嘌呤碱分解的终产物而排泄.其他生物能进一步降解尿酸为尿嚢素,尿嚢酸,尿素,甚 至氨. 2.嘌呤的分解首先是由各种脱氨酶水解脱去氨基,腺嘌呤转化成次黄嘌呤,鸟嘌呤转化为黄嘌呤.脱氨反应也可在核苷或核苷酸水平 上发生.在动物组织中,腺嘌呤脱氨酶的含量极少,而腺苷酸脱氨酶和腺苷脱氨酶的活性较高,生成的次黄苷酸和次黄苷经磷酸化酶催化 生成次黄嘌呤,然后在黄嘌呤氧化酶作用下氧化生成尿酸. 3.在人体内嘌呤的分解主要在肝脏,小肠及肾脏中进行.正常人血浆中尿酸的含量为 20～60mg/L,超过 80 mg/L 时,尿酸盐晶体沉积 于关节,软组织,软骨及肾而导致关节炎,尿路结石和肾病,称痛风症.治疗痛风的常用药物是别嘌呤醇,与次黄
嘌呤结构非常类似,在 细胞内被转换为别黄嘌呤,是黄嘌呤脱氢酶的一个很强的抑制剂,可防止非正常的高水平的尿酸的形成. 三,嘧啶碱的分解 1.有氨基的嘧啶先水解脱氨, 如胞嘧啶脱氨生成尿嘧啶. 在人和某些动物体内其脱氨过程也可能在核苷或核苷酸水平进行. 先是 5' 核 苷酸酶水解三种嘧啶核苷酸生成相应的核苷和磷酸,然后,胞苷经胞苷脱氨酶催化脱氨形成尿苷.尿苷和胸苷经磷酸化酶磷酸解分别生成 尿嘧啶和核糖-1-磷酸以及胸腺嘧啶和脱氧核糖-1-磷酸. 2.嘧啶降解产物易溶于水,有氨,碳酸,β-丙氨酸或β-氨基异丁酸.进一步降解生成乙酰 C0A 和琥珀酰 C0A. 胞嘧啶→尿嘧啶→二氢尿嘧啶→β-脲基丙酸→β-丙氨酸→乙酰 C0A→TCA 胸腺嘧啶→二氢胸腺嘧啶→β-脲基异丁酸→β-氨基异丁酸→琥珀酰 C0A→TCA 3.在哺乳动物中,嘧啶的降解主要在肝脏进行. 第二节 核苷酸的生物合成 一,合成的基本途径 1.有从头合成和补救合成两条基本途径.从头合成是由简单的前体分子(如氨基酸,CO2,NH3,戊糖磷酸)经过较复杂的酶促反应 逐步合成核苷酸,是主要途径.补救合成是利用体内游离的碱基或核苷合成核苷酸,是省能的,简单的反应过程,消耗的 ATP 少,节省一 些氨基酸的消耗. 2.肝组织主要进行从头合成,而脑,骨髓,红细胞等只能进行补救合成.新生及年轻组织的内源性核苷酸从头合成比例大;而衰老组 织及肝功能降低时,补救合成比例增大. 二,嘌呤核苷酸的合成 (一)从头合成 1.原料和部位 用同位素标记示综实验,证明生物体内能利用二氧化碳,甲酸盐,谷氨酰胺,天冬氨酸和甘氨酸作为合成嘌呤环的前体.嘌呤环的 N-1 来自天冬氨酸的氨基;N-3,N-9 来自谷氨酰胺的酰胺基;C-2,C-8 的来自甲酸盐;C-6 来自 CO2;C-4,C-5,N-7 来自甘氨酸. 从头合成的器官主要有肝脏,小肠粘膜及胸腺,在胞液中进行 2.反应过程 嘌呤核苷酸合成的起始物是核糖-5-磷酸(来自戊糖磷酸途径) ,PRPP 合成酶催化 ATP 的焦磷酸基团转移到核糖-5-磷酸的 C-1,形成 PRPP.从头合成的最初产物是次黄嘌呤核苷酸(IMP) ,其他各种嘌呤核苷酸都是 IMP 衍生而来. (1)次黄嘌呤核苷酸的合成 由 PRPP 到 IMP 的合成过程有十步反应,全过程含酰胺键合成,脱水环化,酰基化,氨基化和裂解几个类型的反应: 第一阶段第 5 步反应形成咪唑五元环.先是 PRPP 转酰胺酶(关键酶)催化 PRPP 脱去焦磷酸并结合来自谷氨酰胺的氨基,生成 5-磷酸 核糖胺(PRA) .然后由甘氨酰胺核苷酸合成酶,甘氨酰胺核苷酸转甲酰基酶,甲酰甘氨脒核苷酸合成酶,氨基脒唑核苷酸合成酶依次将 甘氨酸,一碳单位等基团连接上去形成 5-氨基咪唑核苷酸(AIR) . 第二阶段的第 10 步反应形成嘧啶六元环.涉及的酶有氨基脒唑核苷酸羧化酶,氨基脒唑琥珀基氨甲酰核苷酸合成酶,腺苷酸基琥珀 酸裂解酶,氨基脒唑氨甲酰核苷酸转甲酰基酶,IMP 环化水解酶. (2)AMP 和 GMP 是 IMP 的衍生物 由 IMP 合成 AMP 的两
步反应类似于 IMP 合成中的第(7)(8)步反应.腺苷酸基琥珀酸合成酶与腺苷酸基琥珀酸裂解酶催化,消耗 , GTP,反应是可逆的. IMP 转换成 GMP 在 IMP 脱氢酶和 GMP 合成酶催化下完成,先氧化成 XMP,再以谷氨酰胺上的酰胺基取代 XMP 中 C-2 上的氧,消 耗 ATP,反应是不可逆的. (二)从头合成的调节和抗代谢物 1.调节位点:有 3 处.PRPP 合成酶受 AMP 和 GMP 等的反馈抑制;谷氨酰胺-PRPP 转酰胺酶是最主要的部位,它受到 AMP 和 GMP 等的变构抑制;由 IMP 转变成 AMP 或 GMP 时也受它们的反馈抑制. 2.抗代谢物 抗代谢物是一些与嘌呤,氨基酸或叶酸等结构类似的物质.它们主要以竞争性抑制等方式干扰或阻断嘌呤或嘧啶核苷酸的合成,进而 阻止核酸及蛋白质的合成.肿瘤细胞的核酸及蛋白质合成十分旺盛,抗代谢物具有抗肿瘤作用. 嘌呤类似物有 6-巯基嘌呤(6-MP)等,对急性白血病疗效显著.它竞争性抑制补救合成途径中的 HGPRT 活性,阻止了补救合成途径; 而 6-MP 在体内经酶催化生成巯基嘌呤核苷酸,可阻断 IMP 转变成 AMP 及 GMP,抑制核酸的合成. 氨基酸类似物有重氮丝氨酸及 6-重氮-5-氧正亮氨酸等.它们的结构与谷氨酰胺相似,可干扰谷氨酰胺在嘌呤核苷酸合成中的作用. (三)补救合成 外源的或降解产生的碱基和核苷,可被生物体重新利用.在哺乳动物的某些组织及微生物中广泛存在多种磷酸核糖转移酶,催化嘌呤 碱和 PRPP 合成嘌呤核苷酸.腺嘌呤磷酸核糖转移酶催化腺嘌呤与 PRPP 形成 AMP 和 PPi(PPi 水解,使得反应不可逆) .次黄嘌呤-鸟嘌 呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)催化次黄嘌呤转变为 IMP 或鸟嘌呤转变为 GMP,同时生成 PPi(此酶的特性使低浓度的 PRPP 条件下,补 救合成比从头合成优先发生) . 19 年,Lesch-Nyhan 描述了一种严重的代谢病,其特征是智力迟钝,痉挛,表现出强制性的自残行为,甚至自毁容貌,称为莱-纳综 合症或自毁容貌症.该病限于男性,是 X 染色体上 HGPRT 酶基因缺陷引起,缺乏 HGPRT 酶的细胞含高浓度的 PRPP,从头合成的速率大 大增加,过量的 IMP 降解的尿酸达到正常的 6 倍,体内过量的尿酸引起该症. 三,嘧啶核苷酸的合成 (一)从头合成 1. 原料和部位 嘧啶环的原料来自谷氨酰胺,天冬氨酸及 CO2.主要在肝脏胞液中进行. 2. 合成过程 与嘌呤核苷酸从头合成不同的是先合成嘧啶环,再与 PRPP 反应形成最初产物尿嘧啶核苷酸(UMP) ,涉及 6 步反应. (1)UMP 的合成 氨甲酰磷酸合成酶(CPS-Ⅱ)催化谷氨酰胺,HCO3-和 ATP 生成氨甲酰磷酸(在真核生物中,有两种氨甲酰磷酸合成酶,线粒体中的 是 CPS-I,是首先发现的,生成的氨甲酰磷酸用于合成尿素;胞液中的 CPS-Ⅱ,催化嘧啶合成的第一步关键反应) . 天冬氨酸转氨甲酰酶催化氨甲酰磷酸结合天冬氨酸生成氨甲酰天冬氨酸;二氢乳清酸酶将其环化;二氢乳清酸脱氢酶进一步氧化生成 乳清酸;然后由乳清酸磷酸核糖转移酶催化乳清酸与 PRPP
反应生成乳清苷酸(OMP) ,乳清苷酸脱羧酶催化脱羧生成 UMP. (2)CTP 是由 UMP 合成的 UMP 转换成 CTP 涉及三步反应.尿苷酸激酶催化 ATP 的γ-磷酸转移给 UMP 形成 UDP,核苷二磷酸激酶催化第二个 ATP 的γ-磷酸 转移给 UDP 生成 UTP,最后 CTP 合成酶催化来自谷氨酰胺的酰胺氮转移至 UTP 的 C-4,形成 CTP. (3)脱氧核苷酸的合成 在大多数生物中, ADP, GDP, CDP 和 UDP 四种核苷二磷酸可在核苷二磷酸还原酶的催化下生成相应的脱氧核苷二磷酸 dNDP. NADPH 为合成的还原力,电子从 NADPH 向还原酶转移需要经过黄素蛋白和硫氧还蛋白的转递. DNA 合成需要的 dTMP 是由 dUMP 甲基化形成的. 首先 dUDP 转换为 dUMP (有多条途径, 一条是核苷单磷酸激酶催化 dUDP 与 ADP 反应生成 dUMP 和 ATP;另一条是 dUDP 先形成 dUP,然后水解生成 dUMP 和 PPi.dCMP 经脱氨也可形成 dUMP) .dUMP 转换成 dTMP 的反应是由胸苷酸合成酶催化的, N5,N10–CH2-FH4 提供一碳单位后,形成二氢叶酸,经二氢叶酸还原酶催化又成为 FH4,再在丝氨 酸羟甲基转移酶催化下,结合丝氨酸生成 N5,N10 –CH2-FH4. (二)从头合成的调节和抗代谢物 1.调节位点 原核生物和真核生物从头合成的酶不同,途径受到的调节也不同. 大肠杆菌嘧啶核苷酸的合成在三个控制点上受到终产物的反馈抑制.第一 个调节酶是氨甲酰磷酸合成酶,它受 UMP 反馈抑制.另两个调节酶是天冬氨酸转氨甲酰酶(主要调节位点)和 CTP 合成酶,它们受 CTP 的反馈抑制. 在哺乳动物,主要调节酶氨甲酰磷酸合成酶Ⅱ受 UMP 反馈抑制,PRPP 和 IMP 可以激活该酶. 嘧啶与嘌呤两类核苷酸合成上有协制关系,PRPP 合成酶是共同需要的酶,可同时接受这两类核苷酸的反馈调节. 2.抗代谢物 5-氟尿嘧啶(5-FU)的结构与胸腺嘧啶相似,在体内经补救合成途径转变为脱氧 5-氟尿嘧啶核苷酸后,可抑制胸苷酸合成酶,阻断 dUMP 合成 dTMP. 氨基蝶呤及氨甲蝶呤都是叶酸的结构类似物,能与二氢叶酸还原酶发生不可逆结合,结果阻止四氢叶酸的生成,从而抑制了它参于的 各种一碳单位转移反应.氨甲蝶呤的主要作用点是 dTMP 合成中的一碳单位转移反应. 大多数正常细胞的要比癌细胞慢得多,对氨甲蝶呤的敏感性低. (三)补救合成 催化 UMP 补救合成的酶类有尿嘧啶磷酸核糖转移酶,尿苷磷酸化酶,尿苷激酶.催化的反应如下: 尿嘧啶 + PRPP → UMP + PPi 尿嘧啶 + R-1-P → 尿苷+ Pi 尿苷 + ATP → UMP + ADP 的生物合成(复制) 第九章 DNA 的生物合成(复制) 教学目标: 教学目标: 1.掌握 DNA 复制的概念,特点和参与复制的酶与蛋白质.比较原核细胞 DNA 复制与真核细胞 DNA 复制的不同. 2.掌握反转录的概念,反转录酶,主要反应过程. 3.了解 DNA 损伤的概念,影响因素和修复方式. 4.了解基因重组,DNA 克隆,聚合酶链式反应的概念. 导入:DNA 的生物合成反应有三种方式:DNA 指导的 DNA 合成,RNA 指
导的 DNA 合成和修复合成.第一种就是 DNA 复制,是最 主要的合成方式.复制是指遗传物质的传代,以母链 DNA 为模板合成子链 DNA 的过程.碱基配对规律和 DNA 双螺旋结构是复制的分子 基础,其化学本质是酶促的生物细胞内单核苷酸聚合.本章重点讲述复制的特点,机制和过程. 第一节 DNA 的复制自从 1953 年 Watson 和 Crick 提出了 DNA 双螺旋结构模型和 DNA 半保留复制假说后,关于遗传信息的传递,科学界出现了一场空前 热烈的探索.遗传信息以密码的形式编码在 DNA 分子上,通过 DNA 复制由亲代传递给子代;在子代的生长发育过程中又自 DNA 转录给 RNA,然后翻译成特异的蛋白质,以执行各种功能,使后代现出与亲代相似的遗传性状. 一,DNA 的半保留复制(semiconservation replication) 1.概念:DNA 复制的一种方式.每条链都可作为合成互补链的模板,合成出的两分子双链 DNA,每个分子都是由一条亲代链和一条 新链组成. 2.实验证明:1958 年,Meselson 和 Stahl 通过一个著名的实验证明了 Watson 和 Crick 的推测.实验设计是以大肠杆菌为材料,培养基 以 15N 标记的 NH4Cl 作为 N 的惟一来源(重氮培养基) .经过 15 代传代培养,使其 DNA 全部变成[15N]DNA.然后转移到轻氮培养基传 代培养,每隔一定时间取样,对 DNA 进行分析(CsCl 密度梯度离心) ,其结果呈规律性的变化: 在 0 代细菌中,DNA 双链中氮的分布为 15N/15N,对 DNA 密度梯度离心,得浮力密度为 1.724g/ml;在第 1 代细菌中,DNA 双链中 氮的分布由 15N/15N 转为 15N/14N, 其浮力密度为 1.717g/ml; 在第 1 代以后的细菌中, DNA 双链中氮分布有两种, 15N/14N 和 14N/14N; 即 随着传代次数的增加,双链均含 14N 的 DNA 的比重越来越高. 1963 年 Cairus 用放射自显影的方法第一次观察到完整的正在复制的大肠杆菌染色体 DNA. 3.意义:半保留复制是 DNA 复制最重要的特征.这种方式使子代保留了亲代 DNA 的全部遗传信息,说明 DNA 在代谢上的稳定性. 物种稳定的分子基础就是遗传的相对保守性,体现在代与代之间 DNA 碱基序列的一致性,或者说某种生物的后代只能是它的同种生物而 不是其他. 二,DNA 复制的起点和方式 基因组能进行复制的单位称为复制子(replicon) .每个复制子都含有控制复制起始的起点(origin) ,可能还有终止复制的终点 (terminus) . (一)环状 DNA 双链的复制 大肠杆菌 DNA 复制始于单一起点或原点(oriC) ,双向,等速,对称进行.在电镜下复制的起点与复制的 DNA 部分犹如眼睛,称复 制眼,包括两个反向运动的复制叉(replication fork) ,形成θ型.复制叉移动速度约 50000 bp/min.染色体完成复制需要 40 min. 某些病毒及噬菌体 DNA 复制时,可以观察到单向滚环型复制.在哺乳类动物线粒体 DNA 复制中发现,两条链的合成是高度不对称, 一条链上迅速合成出互补链,另一条则为游离的单链环(即 D-环) . (二)线性 DNA 双链的复制 真
核生物染色体 DNA 是线性双链分子,含有许多复制起点,因此是多复制子.虽然其复制叉移动慢(1000~3000bp/min) ,但同时起 作用的复制叉数目大,DNA 复制的总速度比原核生物还快. 三,与 DNA 复制有关的酶 DNA 指导下的 DNA 合成,是一个复杂,有序的酶促反应过程,涉及几十种酶和因子参与. 1.DNA 聚合酶(polymerase) 1956 年 Kornberg 等首先从大肠杆菌中发现 DNA-polI,能催化脱氧核苷酸加到引物链的 3′-OH 末端,引物延伸方向 5′→3′.该 酶需要的条件:4 种 dNTP,Mg2+,DNA 模板(template) ,引物(primer) ,此酶有三种活性:5′→3′聚合酶,5′→3′外切酶(切除 引物和突变片段) ,3′→5′外切酶(校正活性) . 70 年代初又从大肠杆菌分离出 DNA-polⅡ和 polⅢ.polⅡ无 5′→ 3 ′外切酶活性.polⅢ是大肠杆菌主要的 DNA 聚合酶,其全酶由 10 种亚基组成,α,ε,θ组成核心酶,α亚基具有 5′→ 3′方向合成 DNA 的催化活性,ε亚基具有 3′→ 5′核酸外切酶的活性, 起校对作用. DNA polⅢ为异二聚体, DNA 解开的双链可同时进行复制. 使 这种复杂的亚基结构使其具有更高的忠实性, 协同性和持续性. 2.拓扑异构酶(topoisomerase)和解链酶(helicase) 环状 DNA 的三级结构(超螺旋)存在拓扑异构体, \"拓扑\"一词原意是指物体做弹性移位而又保持不变的性质.DNA 复制时必先要 解旋和解链,拓扑异构酶对 DNA 分子兼有内切酶和连接酶的作用,有I型和Ⅱ型.前者可切断双链中的一条链,使解旋中不致打结(适 时又把切口封闭,DNA 呈松弛态,这过程不耗能) .后者在无 ATP 供能时,可同时切开超螺旋状态 DNA 的两条链,使其松弛,然后将切 口封闭(用于分离复制后的两个子环) .在利用 ATP 时,该酶可使松弛态的 DNA 变成负超. 解链酶可通过水解 ATP 供能来解开双链,每解开一对碱基,需水解 2 分子 ATP.该酶和 rep 蛋白共同参与解链,rep 蛋白是沿着前导 链的模板(母链)3′→5′方向移动,而解链酶按母链 5′→3′方向移动. 3.引物酶(primase)和引发体 DNA 聚合酶没有催化两个游离 dNTP 聚合的能力,而 RNA 聚合酶依靠模板可酶促游离 NTP 聚合,生成的一段短 RNA 引物提供 3′OH 末端供 dNTP 加入,延长.所以,解开双链并不是马上进行复制,先以模板脱氧核苷酸序列,按碱基互补原则合成一小段 RNA 引物, 这一过程称\"引发\" .引物 RNA 与模板 DNA 形成杂交.催化 RNA 引物合成的 RNA 聚合酶称引物酶(或引发酶) .该酶只有与相关的蛋 白结合为引发体才有明显的活性.引发体是解链酶,DnaC,引物酶和 DNA 起始复制区组成的复合结构. 4.DNA 连接酶(DNA ligase) 催化相邻 DNA 片段间的连接,即把有缺口的 3′OH 末端与相邻核苷酸 5′-磷酸连接形成磷酸二酯键,连接反应是耗能的.大肠 杆菌的 DNA 连接酶以 NAD+为能量来源,动物细胞和某些噬菌体以 ATP 为能量来源.这两个 DNA 片段必需与同一个互补链结合. 5.单
链结合蛋白(single-strand bindingprotein,SSB) 一旦 DNA 双螺旋解开成单链,SSB 便牢固地结合到分开的单链上,防止它们重新形成双螺旋,保证模板链的复制和不被核酸内切酶 水解.原核生物的 SSB 与 DNA 的结合表现出明显的协同效应,当第一个 SSB 结合后,其后的 SSB 与 DNA 的结合力可提高 103 倍,且结 合迅速扩展,直到全部单链 DNA 都被 SSB 覆盖.而真核生物的 SSB 没有此协同效应,也不象 DNA 聚合酶那样沿复制方向向前移动,而 是不断地结合,脱离,直到复制完成. 6.其他因子 和引发酶结合成引发体的相关蛋白有 6 种,priA,priB,priC, ,dnaB,dnaC,dnaT.与复制过程有关的起始因子,终止蛋白因子等. 四,DNA 半不连续复制 DNA 分子的两条链是反向平行且互补的,而所有已知的 DNA 聚合酶的合成方向都是 5′→ 3′.这很难说明 DNA 在复制时两条链 同时作为模板合成新的互补链.为了解决这个矛盾,1968 年, 日本学者冈崎通过实验研究 (3H 标记的脱氧胸苷的密度梯度离心技术),提 出了半不连续复制理论. DNA 解链复制时,以 3′→ 5′走向为模板的复制链可顺着解链方向延 长,其复制过程是连续的,此链称为前导链(leading strand) .而沿着解链方向 5′→ 3′模板链合成的互补链,出现了复制方向 与解链方向相反,此时,必须等模板链解出足够长度,在引物 3′-OH 末端,沿 5′→ 3′方向先合成小的 DNA 片段(冈崎片段) ,这些 片段是不连续的,最后连成一条完整的链,称后随链(lagging strand) .前导链的连续性在许多因素作用下也会出现不连续性.如模板链的 损伤,一条链上有多个复制起始点,复制因子和底物供应不足等,都会引起前导链复制的中断,并从一新的起始点开始复制.前导链和后 随链是指同一复制叉上的两条链. 五,原核生物 DNA 的复制过程 (一)复制的起始 这是复制中较复杂的环节,参与因子较多,是把 DNA 解成单链和生成引物. E.coli 复制始于单个位点(oriC) ,有 245bp 的序列,一般含两个反向重复单位和三个串联重复单位. 解链是一种高速的反向旋转,其下游势必发生打结现象.拓扑酶通过切断,旋转和再连接作用,实现 DNA 超螺旋的转型,正超螺旋 变负超;DnaA 蛋白辩认并结合 oriC 重复序列的位点,解链酶(DnaB 蛋白,rep 蛋白)解开双链(DnaC 蛋白协助解链) ;SSB 和引发酶进 入,生成的引发体到达适当位置就可按模板催化 NTP 的聚合,生成引物,这标示复制起始的完成.后随链是不连续复制的,引发体需多 次生成. (二)复制的延长 DNA-polⅢ在引物的 3′-OH 端,按模板碱基序,催化加入的 dNTPs 生成磷酸二酯键,子链的延长按 5′→3′方向延伸,其速度相当 快.E.coli 基因组,即全套基因染色体上的 DNA 约 3 000kb.按 20 分钟繁殖一代,每秒加入的核苷酸数达 2500bp.随从链先是生成若干 短的冈崎片段,片段之间的连接由 RNA 酶水解去掉引物,留下的空缺(gap)由 DNA-polI催化填补,再由 DNA 连接酶将两个片
段连在 一起. (三)复制的终止 一般说来,复制的终止不需要特定的信号,未发现有关的酶.E.coli 环状 DNA 是双向复制,起始点和终点刚好把环分为两个半圆,两 个方向各进行 180 度,复制至最后的 3′-OH 末端,可延长填补起始复制时形成的引物所留下的缺口. 六,真核生物 DNA 的复制 真核生物基因组比原核生物大得多,其染色体以核小体为结构单位组成,因此 DNA 的复制过程相当复杂.其特点: 1.有多个复制原点,可分段复制.一个复制叉的移动速度虽比原核生物慢,且不连续,但利用多个复制原点可加速复制,所以总的复 制速度还是快的. 2.真核生物 DNA 聚合酶有 5 种,以α,β,γ,δ,ε命名.polα主要催化合成引物,随从链多次合成的引物包含有 DNA 片段. polδ有解螺旋酶的活性,催化链的延长.β与ε修复 DNA,γ复制线粒体 DNA. 3.端粒复制 端粒(telomere)是真核生物染色体线性 DNA 分子末端的结构.形态学上,像两顶帽子盖在染色体两端.端粒在维持染色体的稳定性 和 DNA 复制的完整性上有重要作用. 线性 DNA 复制终止时,新链最早出现的 5′-端引物被降解后,留下的空缺没法填补,导致 DNA 末端有可能缩短.事实上染色体多 次复制并没有变短,这是因为端粒有一特化的 DNA 序,富含 T,G 短序列的多次重复.端粒酶可催化端粒的复制. 端粒酶(telomerase)是 1985 年发现的一种核糖核蛋白酶,由三部分组成:端粒酶 RNA,端粒酶协同蛋白和端粒酶逆转录酶.该酶兼 有提供 RNA 模板和催化逆转录的功能, 通过一种称为爬行模型的机制维持染色体的完整. 端粒酶结合后, 依其 RNA 模板, 在端粒单链 3′ -OH 为引物基础上,不断反向转录,催化其延长,到一定长度,形成 G-G 配对的发夹结构,3′-OH 端回折与互补链方向一致,端粒酶脱 落,由 DNA 聚合酶催化,按新延伸的链为模板合成互补链.DNA 末端复制变短和用端粒酶增加其长度,这两个过程处于平衡状态,所以 染色体保持大致相同的长度. 第二节 反转录一,反转录概念和反转录酶 反转录(reverse transcription)是以 RNA 为模板,由反转录酶催化 dNTP 合成 DNA,又称逆转录或 RNA 指导的 DNA 合成. 1970 年 Temin 和 Baltimore 分别从致癌 RNA 病毒中发现 RNA 指导的 DNA 聚合酶.逆转录酶催化的 DNA 合成反应要求有模板和引 物,以 4 种脱氧核苷三磷酸为底物,此外还需适当浓度的 Mg2+和还原剂(以保护酶蛋白中的巯基),DNA 链的延长方向是 5′→3′.此 酶是一种多功能酶, 兼有 3 种酶的活力. ①RNA 指导的 DNA 聚合酶活力, 即利用 RNA 为模板, 在其上合成互补的 DNA, 形成 RNA-DNA 杂合分子;②核糖核酸酶 H 的活力,专门水解 RNA-DNA 杂合分子的 RNA.③DNA 指导的 DNA 聚合酶的活力,在新合成的 DNA 链上 合成另一条互补 DNA 链,形成双链 DNA 分子. 二,反转录过程和生物学意义 所有已知的致癌 RNA 病毒都含有反转录酶,又称反转录病毒.其生活周期十分复杂,最关键的
是反转录过程.有 10 步反应,需反转 录酶两次转换模板.先依 RNA 为模板先合成一条互补 DNA(cDNA)链,形成 RNA-DNA 杂交体;随后核糖核酸酶(RNaseH)水解它, 除去 RNA 得 cDNA 单链( 称负链 DNA,记作 DNA-);继而以 DNA(-)为模板合成 DNA(+). 反转录的发现证明遗传信息可以从 RNA 到 DNA,传统的\"中心法则\"得以修正,1975 年二人获诺贝尔生理学与医学奖. 研究表明,反转录病毒有致癌作用,其基因组含癌基因(oncogene,onc) .正常人的细胞基因组含原癌基因(pro-onc) ,在胚胎发育 期有明显的表达,而成年个体极少表达.当一些化学致癌物诱发这些基因表达时,细胞将发生癌症(白血病等) .1983 年发现的 HIV 是一 类反转录病毒,感染人的 T 淋巴细胞即杀死细胞,造成人的免疫系统损伤,引起 AIDS. 第三节 DNA 损伤与修复 DNA 复制的保真性是维持物种相对稳定的主要因素,而 DNA 复制时的错误是突变(mutation)发生的原因.突变是生物进化和细胞 分化的分子基础.所以遗传的稳定性和突变的绝对性组成生物界对立统一的自然现象,使生物世界五彩缤纷. 一,DNA 突变和损伤的概念 突变是指 DNA 分子碱基的改变或表型功能的异常变化. 是通过复制而遗传给子代的永久性 DNA 序列的改变, 逃脱或躲过细胞修复系 统.DNA 损伤通常指 DNA 序列可修复的变化(主要是 DNA 复制中一条链上经修复系统改正的变化) . 突变有自发和诱发两种,其表现是:只有基因型改变而无表型改变(DNA 多态性和个体差异的基础) ,表型改变(遗传病和遗传倾向 性的病的原因)和致死性突变.在复制过程中自然发生的突变几率极低,约为 10-9,而外界因素引起的诱变研究不断深入,其形式有:错 配(点突变) ,缺失,插入和倒位. 点突变指 DNA 分子上一个碱基的改变; 缺失指一个碱基或一段核苷酸序列从 DNA 分子上消失; 插入指一个或一段原来没有的核苷酸 序列插入到 DNA 分子中间;倒位指 DNA 链内较大片段的重组(反置或内迁) . 物理因素多见于紫外线照射,引起 DNA 分子结构中出现嘧啶二聚体.化学因素主要有烷化剂,亚盐和抗生素及类似物.前两者 引起 DNA 分子中碱基改变,后
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