4-1BBL胞外区蛋白增强DC介导的CTL对肝癌细胞的杀伤作用

第１４卷１期２００８年３月

天津医科大学学报

ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＴＩＡＮＪＩＮＭＥＤＩＣＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．１Ｍａｒ．２００８

４－１ＢＢＬ胞外区蛋白增强ＤＣ介导的ＣＴＬ

对肝癌细胞的杀伤作用

吴尘轩１，郭红星２，杜智１，３

（１．天津医科大学第三中心临床学院，天津３００１７０；２．中国医学科学院血液学研究所；

３．天津市人工细胞重点实验室）

［摘要］目的：探讨致敏树突状细胞（ＤＣ）诱导的细胞毒Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）在４－１ＢＢＬ胞外区蛋白（ｅｘ４－１ＢＢＬ）辅助下对于肝癌细胞杀伤的增强作用。方法：ＥＬＩＳＡ法检测ｅｘ４－１ＢＢＬ对ＣＴＬ分泌ＩＬ－２和ＩＦＮγ水平的促进作用；非放射性

ＬＤＨ试剂盒检测不同时间点对淋巴细胞存活的影响；应用致敏ＤＣ诱导ＣＴＬ细胞毒试验，观察联合应用ｅｘ４－１ＢＢＬ后ＣＴＬ对肝癌细胞杀伤效应。结果：ｅｘ４－１ＢＢＬ可使ＣＴＬ分泌ＩＬ－２和ＩＦＮγ显著增加（Ｐ＜０．０１），但对于未激活的原始淋

巴细胞无明显刺激作用；ｅｘ４－１ＢＢＬ可降低培养基上清中淋巴细胞释放的乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）的含量，改进淋巴细胞的存活状态；致敏的脐血来源ＤＣ能够在体外诱导ＣＴＬ特异性地杀伤肝癌细胞，经ｅｘ４－１ＢＢＬ作用后ＣＴＬ的杀伤作用显著增强。联合应用致敏ＤＣ和ｅｘ４－１ＢＢＬ的实验组，在效靶比２０∶１时的杀伤百分率为（５２．１６±１．８４）％，而对照组没有联合ｅｘ４－１ＢＢＬ，在同样的效靶比其杀伤百分率为（４３．５±１．５）％。结论：ｅｘ４－１ＢＢＬ可使ＤＣ诱导的ＣＴＬ对肝癌细胞杀伤效应增加，这一结果与ｅｘ４－１ＢＢＬ通过共刺激信号通路促进ＣＴＬ增殖，增加细胞因子分泌，维持杀伤活性有关。［关键词］４－１ＢＢＬ；癌，肝细胞；树突细胞；细胞毒Ｔ淋巴细胞［中图分类号］Ｒ７３５．７；Ｒ７３－３６＋２

［文献标识码］Ａ

［文章编号］１００６－８１４７（２００８）０１－００１８－０４

Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｏｍａｉｎｏｆｈｕｍａｎ４－１ＢＢＬｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｌｙｓｉｓｏｆ

ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓｍｅｄｉａｔｅｄｂｙＤＣ－ｉｎｄｕｃｅｄＣＴＬ

ＷＵＣｈｅｎ－ｘｕａｎ１，ＧＵＯＨｏｎｇ－ｘｉｎｇ２，ＤＵＺｈｉ１，３

（１．ＴｈｅＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＴｈｉｒｄＣｅｎｔｅｒＨｏｓｐｉｔａｌ，ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００１７０，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ，

ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ；３．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＣｅｌｌｓｏｆＴｉａｎｊｉｎ）

ＡＢＳＴＲＡＣＴＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｓｔｕｄｙｗｈｅｔｈｅｒｅｘｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎｏｆ４－１ＢＢＬ（ｅｘ４－１ＢＢＬ）ｃｏｕｌｄｅｎｈａｎｃｅｔｈｅＤＣ－ｍｅｄｉａｔｅｄｓｐｅｃｉｆｉｃＣＴＬｌｙｓｉｓｏｆｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅＳＭＭＣ－７７２１．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＤＣｓｗｅｒｅｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｈｕｍａｎｃｏｒｄｂｌｏｏｄａｎｄｗｅｒｅｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄｗｉｔｈｌｙｓａｔｅａｎｔｉｇｅｎｏｆＳＭＭＣ－７７２１ｏｒｕｎｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ．Ｔｈｅａｕｔｏｌｏｇｏｕｓｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｕｎｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄＤＣｓａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄＤＣｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙａｔｔｈｅｒａ－ｔｉｏｏｆ２０∶１ｗｉｔｈｏｒｗｉｔｈｏｕｔｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｅｘ４－１ＢＢＬ．ＥＬＩＳＡｗａｓｕｓｅｄｔｏｍｅａｓｕｒｅｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆＩＬ－２ａｎｄＩＦＮγｂｙｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｉｎｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｅｘ４－１ＢＢＬｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙａｎｏｎ－ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅｄＬＤＨａｓｓａｙｋｉｔ．Ｉｎｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙａｓｓａｙ，ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ｔｈｅｅｆ－ｆｅｃｔｏｒｃｅｌｌｓ，ｗｅｒｅｐｒｉｍｅｄｂｙｕｎｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄＤＣｓａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄＤＣｓｗｉｔｈｏｒｗｉｔｈｏｕｔｅｘ４－１ＢＢＬ．Ｔｈｅｓｕｓｃｅｐｔｉ－ｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｔｏＣＴＬｌｙｓｉｓｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｅｘ４－１ＢＢＬｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙｎｏｎ－ｒａｄｉｏａｃｔｉｖａｔｅｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｔｅｓｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｅｘ４－１ＢＢＬｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＩＬ－２ａｎｄＩＦＮγｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙＣＴＬｗｉｔｈａｄｒａｍａｔｉｃｕｐ－ｇｏｉｎｇａｔｔｈｅｔｉｍｅｏｆ４８ｈａｎｄ７２ｈｄｕｒｉｎｇｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄｃｏｕｌｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅ－ｃｒｅａｓｅｔｈｅＬＤＨｉｎｔｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ，ｂｅｎｅｆｉｔｉｎｇｔｈｅｓｔａｔｕｓｏｆｖｉａｂｌｅｃｅｌｌｓ．Ｖａｃｃｉｎｅｏｆｃｏｒｄｂｌｏｏｄｄｅｒｉｖｅｄ－ＤＣｓ

基金项目：天津市科委人工细胞重点实验室建设基金资助项目（０５ＳＹＳＹＪＣ０２６００）；天津市科委攻关项目（０５ＹＦＳＺＳＦ０２５００）

作者简介：吴尘轩（１９６８－），女，副主任医师，博士在读，研究方向：肝癌综合治疗与肿瘤免疫；杜智（１９５３－），男，教授，主任医师，博士生导师，研究方向：肝胆胰脾疾病，人工肝。

第１期吴尘轩，等．４－１ＢＢＬ胞外区蛋白增强ＤＣ介导的ＣＴＬ对肝癌细胞的杀伤作用

１９

ｈａｄａｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｎｇｒｏｗｔｈｏｆＳＭＭＣ－７７２１ｗｉｔｈａｋｉｌｌｉｎｇｒａｔｅｏｆ（４３．５±１．５０）％．Ｔｈｅｅｆｆｉｃａｃｙｃｏｕｌｄｂｅｉｍｐｒｏｖｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｂｙｅｘ４－１ＢＢＬａｎｄｔｈｅｋｉｌｌｉｎｇｒａｔｅｗａｓ（５２．１６±１．８４）％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｅｘ４－１ＢＢＬｃｏｕｌｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｃｙｔｏｔｏｘｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｎｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｅｎ－ｈａｎｃｅｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｃｙｔｏｋｉｎｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＣＴＬ．ＫＥＹＷＯＲＤＳ４－１ＢＢＬ；Ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ；Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ；ＣｙｔｏｔｏｘｉｃＴｃｅｌｌ

设法增强树突状细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ，ＤＣ）诱导的细胞毒Ｔ淋巴细胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＣＴＬ）的特异性抗肿瘤效果，是当前肿瘤免疫治疗的重要策略之一。共刺激分子４－１ＢＢＬ／４－１ＢＢ可以延伸ＴＣＲ信号的作用时间，降低对ＴＣＲ信号的应答域值，因此可以考虑通过这种机制来改变非最佳状态的免疫反应［１］。如果使得肿瘤杀伤过程中的主要参与者效应细胞ＣＴＬ活性增强，就有可能改善杀伤效果。原核表达的可溶性４－１ＢＢＬ胞外区蛋白（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｏ－

两组，一组条件不变继续培养４８ｈ，得到未致敏ＤＣ；另一组加入人肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７７２１冻融抗原

１５０μｇ／ｍｌ，继续培养４８ｈ后获得致敏ＤＣ。１．２．１．２

自体淋巴细胞增殖反应：淋巴细胞来源于

脐血中非贴壁单个核细胞，将脐血来源的ＤＣ与淋巴细胞按１∶２０比例加入９６孔板，分为４组，每组设

３复孔。Ａ组：未致敏ＤＣ加淋巴细胞；Ｂ组：未致敏

ＤＣ加淋巴细胞，培养液中加入ｅｘ４－１ＢＢＬ（终浓度５００ｎｇ／ｍｌ）；Ｃ组：致敏ＤＣ加淋巴细胞；Ｄ组：致敏ＤＣ加淋巴细胞，培养液中加入ｅｘ４－１ＢＢＬ（终浓度５００ｎｇ／ｍｌ）。于９６孔板培养７ｄ，ＭＴＴ显色法于波长５７０ｎｍ处检测吸光度（Ａ）值，淋巴细胞增殖以刺激

指数（ＳＩ）表示，ＳＩ＝刺激细胞孔Ａ５７０值／不加刺激细胞孔Ａ５７０值。

ｍａｉｎｏｆｈｕｍａｎ４－１ＢＢＬ，ｅｘ４－１ＢＢＬ）能够结合并活化

淋巴细胞，减少活化诱导的细胞死亡（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｉｎ－

ｄｕｃｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈ，ＡＩＣＤ）［２］，同致敏ＤＣ诱导的ＣＴＬ联

合应用，有可能改进抗肿瘤效果。本研究探讨ｅｘ４－细胞因子分泌的变化情况，１ＢＢＬ作用下ＣＴＬ增殖、

并观察ｅｘ４－１ＢＢＬ对于ＤＣ诱导的ＣＴＬ对肝癌细胞体外杀伤作用的影响。

１．２．２水平ＥＬＩＳＡ法检测ＣＴＬ上清中ＩＬ－２和ＩＦＮγ自体淋巴细胞增殖反应中的４组细胞，分别在

１材料与方法

１．１材料与主要试剂

培养的第４８、７２ｈ换液并收集培养上清液。ＥＬＩＳＡ

正常足月剖宫产新生儿脐

法测定细胞培养上清中ＩＬ－２以及ＩＦＮγ含量（按说明书操作）。

血由天津市第三中心医院产科提供；人肝癌细胞株

ＳＭＭＣ－７７２１由天津市医学院惠赠；ｒｈＧＭ－ＣＳＦ

和ｒｈＩＬ－４为英国ＰｅｐｒｏＴｅｃｈＥＣＬＴＤ公司产品；Ｃｙｔｏ－ｔｏｘ９６非放射性细胞毒试剂盒购于Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ｅｘ４－１ＢＢＬ由中国医学科学院血液学研究所药物室

构建并表达纯化。

１．２．３

１．２方法

１．２．１细胞培养与诱导

１．２．１．１树突状细胞的诱导致敏：取对数生长期人肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７７２１，细胞数应达１×１０８，置于－８０℃中３０ｍｉｎ，再迅速放在３７℃水浴中至融化，反复３次，离心去除细胞碎片，取上清液经０．２２μｍ

微孔滤膜过滤作为肿瘤全细胞抗原。取无菌条件下新鲜采集的脐带血，经Ｆｉｃｏｌｌ分离后得到单个核细胞，调整细胞浓度为３×１０６／ｍｌ，在含有１０％血清的

Ｃｙｔｏｔｏｘ９６非放射性细胞毒试剂盒检测ＣＴＬ

上清中ＬＤＨ水平自体淋巴细胞增殖反应中的４组细胞，分别在培养的第４８、７２ｈ换液并收集培养上清液。按说明书操作，检测Ａ５７０值，以其数值大小间接反映细胞培养上清中ＬＤＨ水平。

１．２．４致敏ＤＣ对Ｔ淋巴细胞的刺激作用及体外细胞毒实验分别取上述４组细胞，按照效靶比２０∶１、１０∶１和５∶１加入接种有１×１０４个ＳＭＭＣ－７７２１细胞／孔的９６孔板中进行体外细胞毒实验，每组设３复孔，３７℃培养４ｈ后取上清，按下式结果计算杀伤百分率。细胞杀伤百分比％＝（实验组－效应细胞自发释放－靶细胞自发释放）×１００／（靶细胞最大释放－靶细

胞自发释放）。

１．３统计学处理全部数据采用ＳＰＳＳ１３．０软件进

ＲＰＭＩ－１６４０培养基中培养２ｈ，保留非贴壁的单个核

细胞（混合淋巴细胞），１０％ＦＣＳ的ＰＲＭＩ－１６４０培养备用。贴壁细胞以ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（浓度１００ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＩＬ－４（浓度５０ｎｇ／ｍｌ）诱导培养，于诱导第５天分为

行分析，多个样本均数比较应用ｏｎｅ－ｗａｙＡＮＯ－

ＶＡ分析。２结果２．１

培养细胞上清ＩＬ－２及ＩＦＮγ分泌水平

ＥＬＩＳＡ

２０

天津医科大学学报第１４卷

结果显示Ｃ、Ｄ组分泌ＩＬ－２、ＩＦＮγ明显高于Ａ、Ｂ组（ｎ＝３，Ｐ＜０．０１）；且Ｄ组与Ｃ组比较，分泌的ＩＬ－２、

２．４

用

肿瘤抗原致敏ＤＣ诱导的特异性ＣＴＬ杀伤作

ＩＦＮγ水平也存在统计学差异（ｎ＝３，Ｐ＜０．０１），见表１。

表１组别培养不同时间各组细胞上清ＩＬ－２及ＩＦＮ－γ分泌水平（ｐｇ／ｍｌ）

Ｃ组和Ｄ组的ＤＣ经ＳＭＭＣ－７７２１肿瘤冻融抗

原负载后，可使原始Ｔ淋巴细胞活化而成为ＣＴＬ，特异性杀伤ＳＭＭＣ－７７２１，而Ｄ组中经ｅｘ４－１ＢＢＬ作用

的ＣＴＬ对ＳＭＭＣ－７７２１的杀伤与Ｃ组比较具有更明显的增强作用（见图３）。联合应用致敏ＤＣ和ｅｘ４－

ＩＬ－２４８ｈ１２．６８７９．９７±１０．８５６７．３７±１７．５２﹡２３６．０７±３５２．２３±２６．９３﹡△ＩＦＮ－γ

７２ｈ６．９７７０．８７±６．１６５８．６０±４８ｈ１１．１０１２０．６７±１１．６７１０６．４７±２１．９８﹡３５３．４０±４０３．２０±２４．２９﹡△﹡△７２ｈ１５．３３１２２．７７±８．２２９６．００±１６．７８﹡２７４．１３±３５３．９７±１９．８３﹡△ＡＢＣＤ１ＢＢＬ的实验组，在效靶比２０∶１时的杀伤百分率为

（５２．１６±１．８４）％，而对照组没有联合ｅｘ４－１ＢＢＬ，在同样的效靶比其杀伤百分率为（４３．５±１．５）％。在Ａ组，与未致敏ＤＣ共培养的Ｔ淋巴细胞对ＳＭＭＣ－７７２１存在非特异性的细胞毒作用；而在加入了ｅｘ４－１ＢＢＬ的Ｂ组中亦未见对ＳＭＭＣ－７７２１杀伤有显著提高。

２８．６７﹡３６７．０３±４７９．９０±１８．５８＊与Ａ、Ｂ组比较，Ｐ＜０．０１；△与Ｃ组比较，Ｐ＜０．０１

２．２

Ｃｙｔｏｔｏｘ９６非放射性细胞毒试剂盒检测ＣＴＬ上

清中ＬＤＨ水平４８ｈ时ｅｘ４－１ＢＢＬ可明显抑制致敏

ＤＣ激活的淋巴细胞释放ＬＤＨ，７２ｈ时仍存在此效应，见图１。

图３ＣＴＬ对ＳＭＭＣ－７７２１肿瘤细胞的抑制作用

３讨论

诱导Ｔ细胞增殖分化形成特异性的效应细胞过

程中，需要双重刺激信号。第一信号为ＴＣＲ复合物

图１４８、７２ｈ时各组细胞培养上清中ＬＤＨ水平

同递呈抗原肽的ＭＨＣ分子的作用，第二信号则是通过共刺激分子提供，其中最重要的是ＣＤ２８／Ｂ７信号通路，该信号能够协同诱导Ｔ细胞产生高水平的

２．３自体淋巴细胞增殖反应在培养第４、６、８天，

与致敏ＤＣ共培养的淋巴细胞（Ｃ组）以及加入ｅｘ４－

１ＢＢＬ培养的致敏ＤＣ和淋巴细胞（Ｄ组）增殖明显，ＳＩ显著高于Ａ组及Ｂ组（ｎ＝３，Ｐ＜０．０１，见图２）。

ＩＬ－２，提供必要的存活信息，防止活化诱导的细胞凋

亡以及细胞状态。但是该信号的作用是短暂的，随即被ＣＴＬＡ－４同Ｂ７的作用所抑制。而对Ｔ细胞活化的进一步调节则需要其他一些共刺激分子来完成，用以进一步延伸活化过程，修饰和调节活化后的作用，此类共刺激分子中较重要的即为４－１ＢＢＬ／４－

Ｔ细胞计数（×１０４／ｍｌ）１ＢＢ。４－１ＢＢＬ／４－１ＢＢ是ＴＮＦ受体家族的一个引人注

目的共刺激成员［３］，很多的证据说明其对活化的Ｔ细

胞的免疫增强作用，诸如增加细胞数量，延长存活的时间，甚至增加颗粒酶穿孔素的蓄积，而且应用激动性抗体可增加肿瘤部位的淋巴细胞浸润［４，５］。通过应用激活性单克隆抗体或者修饰肿瘤细胞及抗原递呈细胞使其表达４－１ＢＢＬ，单独或者协同其他的共刺激分子如Ｂ７、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ等，用来对细胞免疫进行

图２

各组淋巴细胞增殖情况

调节，从而起到治疗各种疾病的作用［６￣９］。现有实验数

第１期吴尘轩，等．４－１ＢＢＬ胞外区蛋白增强ＤＣ介导的ＣＴＬ对肝癌细胞的杀伤作用

２１

据证实该信号通路能够有效的减少ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞的活化诱导的细胞死亡（ＡＩＣＤ），同时能够有效扩增淋巴细胞［１０］。人类４－１ＢＢＬ于１９９４由Ａｌｄｅｒｓｏｎ等［１］首次分离。有研究表明，原核表达的可溶性４－１ＢＢＬ胞外区蛋白能够结合并活化淋巴细胞，弥补淋巴细胞和肿瘤细胞作用过程刺激分子低表达的不足，延长淋巴细胞对肿瘤的作用时间，起到增强杀伤的效果［１１］。因此，通过在抗肿瘤治疗中联合应用４－

本研究结果表明，以肝癌全细胞抗原致敏的ＤＣ可有效诱导特异性抗ＨＣＣ免疫应答，借助４－１ＢＢＬ／

４－１ＢＢ途径共刺激效应可起到增强特异性细胞毒性

的作用，可作为有效的免疫治疗的辅助手段，具有很高的应用价值。在采取基于ＤＣ的肝癌特异性免疫治疗中，当ＣＴＬ作用的发挥受到时，可考虑应用４－１ＢＢＬ或其他辅助手段提高疗效。

参考文献：

［１］

１ＢＢＬ胞外区蛋白，有望实现更好地延缓复发甚至根

治肿瘤的治疗目的。

本实验检测了经ｅｘ４－１ＢＢＬ刺激的淋巴细胞的增殖情况、细胞状态以及细胞因子的分泌水平，并观察了在ｅｘ４－１ＢＢＬ作用下脐血来源ＤＣ诱导的ＣＴＬ对于肝癌细胞系杀伤效应的影响。活化Ｔ细胞分泌

ＡｌｄｅｒｓｏｎＭＲ，ＳｍｉｔｈＣＡ，ＴｏｕｇｈＴＷ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎ４－１ＢＢａｎｄｉｔｓｌｉｇａｎｄ［Ｊ］．ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ，１９９４，２４（９）：２２１９

［２］［３］

姜文国，熊冬生，邵晓枫，等．人４－１ＢＢＬ胞外区基因的克隆与表达研究［Ｊ］．生物工程学报，２００５，２１（５）：７０３

ＳｃｈｗａｒｚＨ，ＴｕｃｋｗｅｌｌＪ，ＬｏｔｚＭ．Ａｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｄｕｃｅｄｂｙｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（ＩＬＡ）：ａｎｅｗｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅｈｕｍａｎｎｅｒｖｅ－ｇｒｏｗｔｈ－ｆａｃｔｏｒ／ｔｕｍｏｒ－ｎｅｃｒｏｓｉｓ－ｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｆａｍｉｌｙ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，１９９３，１３４（２）：２９５

ＩＬ－２和ＩＦＮγ的水平可作为细胞毒性效应的检测指标之一，我们采用ＥＬＩＳＡ法测定各组培养细胞分泌

的ＩＬ－２和ＩＦＮγ，发现原始淋巴细胞经致敏ＤＣ活化成为ＣＴＬ后，其ＩＬ－２和ＩＦＮγ分泌量增加，而在

［４］ＬａｄｅｒａｃｈＤ，ＭｏｖａｓｓａｇｈＭ，ＪｏｈｎｓｏｎＡ，ｅｔａｌ．４－１ＢＢｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｅｎｈａｎｃｅｓｈｕｍａｎＣＤ８＋Ｔｃｅｌｌｐｒｉｍｉｎｇｂｙａｕｇｍｅｎｔｉｎｇｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａ－ｔｉｏｎａｎｄｓｕｒｖｉｖａｌｏｆｅｆｆｅｃｔｏｒＣＤ８＋Ｔｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＩｎｔＩｍｍｕｎｏｌ，２００２，１４（１０）：１１５５

ｅｘ４－１ＢＢＬ作用下ＣＴＬ分泌ＩＬ－２和ＩＦＮγ的增加尤为显著；细胞培养上清中ＬＤＨ水平可间接反映淋巴

细胞的存活能力，研究显示ｅｘ４－１ＢＢＬ可使活化淋巴细胞维持更好的生存状态。混合淋巴细胞反应证实ｅｘ４－１ＢＢＬ可有效刺激同源Ｔ淋巴细胞增殖；体外杀伤实验数据显示，负载了ＳＭＭＣ－７７２１抗原的

［５］［６］［７］

ＶｉｎａｙＤＳ，ＫｗｏｎＢＳ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙｔａｒｇｅｔｉｎｇ４－１ＢＢａｎｄｉｔｓｌｉｇａｎｄ［Ｊ］．ＩｎｔＪＨｅｍａｔｏｌ，２００６，８３（１）：２３

ＣｈｅｕｋＡＴ，ＭｕｆｔｉＧＪ，ＧｕｉｎｎＢＡ．Ｒｏｌｅｏｆ４－１ＢＢ：４－１ＢＢｌｉｇａｎｄｉｎｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，２００４，１１（３）：２１５ＳｃｈｗａｒｚＨ，ＶａｌｂｒａｃｈｔＪ，ＴｕｃｋｗｅｌｌＪ，ｅｔａｌ．ＩＬＡ，ｔｈｅｈｕｍａｎ４－１ＢＢｈｏｍｏｌｏｇｕｅ，ｉｓｉｎｄｕｃｉｂｌｅｉｎｌｙｍｐｈｏｉｄａｎｄｏｔｈｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅａｇｅｓ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，１９９５，８５（４）：１０４３

ＤＣ诱导产生的ＣＴＬ对ＳＭＭＣ－７７２１具有显著的特异杀伤作用，而经过增加了ｅｘ４－１ＢＢＬ处理的活化淋巴细胞ＣＴＬ，在不同的效靶比下，均能够进一步增加对肝癌细胞系ＳＭＭＣ－７７２１的特异性杀伤作用。对于未活化的Ｔ淋巴细胞，ｅｘ４－１ＢＢＬ无明显作用。说明通过ｅｘ４－１ＢＢＬ给予活化的淋巴细胞强化的共

刺激信号，可能弥补了肿瘤细胞低表达或者缺失共刺激分子的缺陷，给予了细胞毒淋巴细胞完全的细胞活化信号，从而提高了效应细胞的功能，有效地改善了抗肿瘤效果。（上接第４页）

ｓｐｌｉｃｉｎｇｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９９３，２１（２５）：５８０３［１０］ＲｉｂｂｅｃｋＫ，ＬｉｐｏｗｓｋｙＧ，ＫｅｎｔＨ．ＮＴＦ２ｍｅｄｉａｔｅｓｎｕｃｌｅａｒｉｍｐｏｒｔｏｆ

［８］［９］

ＶｉｎａｙＤＳ，ＫｗｏｎＢＳ．Ｒｏｌｅｏｆ４－１ＢＢｉｎｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ］．ＳｅｍｉｎＩｍｍｕｎｏｌ，１９９８，１０（６）：４８１

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［１０］ＹｏｓｈｉｄａＨ，ＫａｔａｙｏｓｅＹ，ＵｎｎｏＭ，ｅｔａｌ．Ａｎｏｖｅｌａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓ－

ｉｎｇｈｕｍａｎ４－１ＢＢｌｉｇａｎｄｅｎｈａｎｃｅｓａｎｔｉｔｕｍｏｒｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２００３，５２（２）：９７

［１１］ＭａｕｓＭＶ，ＴｈｏｍａｓＡＫ，ＬｅｏｎａｒｄＤＧ，ｅｔａｌ．Ｅｘｖｉｖｏｅｘｐａｎｓｉｏｎｏｆ

ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｄａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｂｙａｒｔｉｆｉ－ｃｉａｌＡＰＣｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｌｉｇａｎｄｓｆｏｒｔｈｅＴ－ｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＤ２８ａｎｄ４－１ＢＢ［Ｊ］．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００２，２０（２）：１４３

（２００７－１２－１２收稿）

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ｒａｎ［Ｊ］．ＥＭＢＯＪ，１９９８，１７（２２）：６５８７

［１１］ＫｅｎｎｅｄｙＤ，ＷｏｏｄＳ，ＲａｍｓｄａｌｅＴ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｍｏｕｓｅｏｒｔｈｏ－

ｏｌｉｎｈａｓａｎｕｎｕｓｕａｌｓｕｐｅｒｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒｉｔｓＲＮＡ－ｈｅｌｉｘ－ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［Ｊ］．ＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９９２，２６７（５）：２９５５

［１４］ＮｉｃｈｏｌｓＲ，ＷａｎｇＸ，ＴａｎｇＪ．ＴｈｅＲＧＧｄｏｍａｉｎｉｎｈｎＲＮＰＡ２ａｆｆｅｃｔｓ

ｌｏｇｕｅｏｆｔｈｅｈｕｍａｎｒａｓ－ＧＡＰ－ＳＨ３－ｄｏｍａｉｎｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎｔｈａｔｔｈｅｓｅｐｒｏｔｅｉｎｓｃｏｎｔａｉｎａｎＲＮＡｒｅｃｏｇ－ｎｉｔｉｏｎｍｏｔｉｆ［Ｊ］．ＢｉｏｍｅｄＰｅｐｔＰｒｏｔ＆ＮｕｃＡｃｉｄｓ，１９９７，２（３）：９３［１２］ＢｕｒｄＣ，ＤｒｅｙｆｕｓｓＧ．Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎｓ

ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＥｘｐＣｅｌｌＲｅｓ，２０００，２５６（２）：５２２

（２００７－１２－２５收稿）