中图分类号 Q93-33 文献标识码 A 文章编号1007-5739(2019)04-0091-03Optimization of Spore Cultural Conditions for Bacillus aerophilus ZDXC-01FAN Jian-long 1 YU Ying-ying 2 QIU Sen-sen 1 YONG Dao-jing 1(1 Qingdao Zhongda Agricultural Science and Technology Co.,Ltd.,Qingdao Shandong 266112； 2 Qingdao Zhongda Biotech Research Institute Co.,Ltd.)
Abstract In order to increase the effective viable count and spore count of Bacillus aerophila, single factor screening and orthogonal test were used to optimize the fermentation conditions.The results showed that the optimum fermentation conditions were as follows .fermentation of 30 to 36 h, inoculation of 5%.culture temperature of 37 T .rotation speed of 200 r/min,initial pH value of 7.5 and the fluid volume of 25 mL/250 mL.The bacteria content of the optimized fermentation broth was 5.8xl09 cfu/mL, increased by 163.6% compared with the initial fermentation process (2.2x 109 cfu/mL) .The spores content of the optimized fermentation broth was 5.5x 109 cfu/mL, increased by 205.6% compared with the initial fermentation process( 1.8xl09 cfu/mL).Key words Bacillus aerophilus : medium optimization ； orthogonal experiment根结线虫(Me/oidogyne spp.)是重要的蔬菜作物寄生线
虫，寄主众多，分布广泛，已成为仅次于真菌的第二大植物
子培养基，30七培养24 h,备用。1.2.2种子培养。将活化的菌种接入装有液体种子培养基的 三角瓶中，30七、180 r/min培养24 h,备用。病害17。根结线虫病害可造成作物减产10%~20%,严重时 可达75%以上叫为了减少化学农药导致的食品安全和环境 问题，生物农药的使用已成为新趋势。芽砲杆菌\"叭交枝顶
1.2.3摇瓶发酵培养。取种子液接入盛有100 mL初始发酵 培养基的三角瓶中(接种量为3%,v/v),pH值调至7.2-7.4,
30 I、200 r/min振荡培养48 h,进行单因素和正交试验的发
抱霉叭木霉叫淡紫拟青霉冋均为重要的生防菌，对根结线虫
病均有一定防效。目前，尚未发现关于嗜气芽砲杆菌防治根结线虫的报道。 笔者所在实验室筛选得到一株对根结线虫具有较好防治
酵培养条件研究。1.3试验设计1.3.1单因子筛选。选择菌株ZDXC-01的接菌量、温度、转 速、起始pH值及装液量等发酵条件进行优化。发酵基本条
件同123。取样进行平板计数，观察活菌数和芽砲形成情
作用的嗜气芽JS杆菌Bacillus aerophilus ZDXC-01，已经获得
国家发明专利——嗜气芽砲杆菌及其杀根结线虫应用(专 利号=201710596659.1 )o有效的活菌数是微生物菌剂重要的
况，每个处理3次重复，初始培养条件作对照，优化1个因
质量指标叭我国对批准生产的菌剂都有明确的有效活菌数
素时其他条件保持不变。接菌量分别设1%、3%、5%、7%、9%(体积百分数)5个
水平；发酵温度分别设25、28、30、37、42 °C 5个水平；转速设 160、180、200、220 r/min 4个水平；培养基起始pH值分别设
量和用量规定㈣。本文通过单因素试验及正交试验优化嗜气
芽砲杆菌发酵培养条件，研究发酵时间、接种量、温度、转速、
起始pH值及摇瓶装液量对ZDXC-01菌株发酵活菌数和芽 砲数量的影响，旨在为该菌株开发生防菌剂提供理论数据。6 个水平,即 6.0、6.5,7.0、7.5、8.0、8.5 ；在 250 mL 的三角瓶中
1材料与方法1.1试验材料1.1.1供试菌种。菌种ZDXC-01，由笔者所在实验室从中国 科学院海洋研究所提供的海洋细菌中筛选得到，通过鉴定，
菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物
分别装入25、50、75、100 mL发酵培养基，优化装液量。1.3.2正交试验设计。在单因子试验发酵条件优化中得到的 接菌量(A)、转速(B)、起始pH值(C)的基础上进行3因素3
水平正交试验。以活菌数和芽抱数为指标，采用1^(丁)正交
表确定各因子的最佳组合(表l)o中心(保藏编号:CGMCC No.l4104)o1.1.2培养基。①液体种子培养基：酵母浸粉1.0%,蛋白腺
1.0%,氯化钠0.5%,水1 000 mL,pH值自然。②固体种子培
表1 L,(34)正交试验设计水平123因素接菌量(A)/%357养基：在液体培养基的基础上添加2%琼脂粉。③发酵培养
基：可溶性淀粉0.5%,豆粕粉1.0%,玉米粉1.0%,KH2PO4 0.1%,NaCl 0.5%,7k 1 000 mL,pH ft 7.2-7.40转速(B)/r-min-*180200220初始pH值(C)6.57.07.51.2培养方法1.2.1菌种活化。将低温甘油保存的菌种转接到固体斜面种 收積日期 2018-10-121.4生长曲线测定以优化后最适培养条件对嗜气芽砲杆菌进行摇瓶发酵 培养，每隔6 h取样，绘制生长曲线,确定最佳培养时间。91植物保护学现代农业科技2019年第4期1.5分析方法活菌数测定采用沈萍等何介绍的方法。芽砲平板计数
和芽砲量都最高，所以选择37T为最佳培养温度；由图1 （b）
可知，当装液量为25 mLV250 mL时，测得的活菌数和芽砲数 都最高，所以选择25 mL/250 mL为最佳装液量；由图1 （c）
是将菌液于80七水浴加热15 min,杀死营养体细胞,釆用梯
度稀释平板涂布法问，芽砲率即芽砲形成数与活菌总数的比 值。釆用芽砲染色法观察芽砲何。可知，当接种量为3%、5%、7%时，活菌数和芽砲率都相对较
高；由图1（d）可知，当转速为180、200、220r/min时，活菌数 和芽砲率都相对较高；由图1（e）可知，当起始pH值为6.5、
7.0、7.5时，活菌数和芽砲数都相对较高。2结果与分析2.1发酵条件单因子筛选由图1（a）可知，当培养温度为37七时，测得的活菌数
LUIn・J0 62x
C3.Z Z.5.0.51.L.0.5LEn・JQ60x
4053.03.Z5Z0L51.O05
O
因此，以最佳培养温度、最佳装液量、培养时间48 h为3..5.03.2.50
2.1.L .5.0Q.5
、帑梱喪
O.O
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3.2 52 0L 5L 0o 5
3.2 z.5 .0L.5 0
装液量/mL
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03. 2.25 01. 1.C55 0 5
接菌量/%L .5^M、^
0 ----------------'----------------1---------------- 0140 160 180 200 220 240 260转速/r-min_l图1培养温度（a）、装液量（b）、接菌量（c）、转速（d）、起始pH值（e）对活菌数和芽胞数量的影响基础，选择接种量3%、5%、7%,转速180.200.220 r/min,起 始pH值6.5、7.0、7.5进入正交试验。c50 -------1----------------------------——丄——05.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0初始pH值
佳组合为A2B2C3,即接种量5%、转速200r/min.起始pH值
7.5。从既保证菌株ZDXC-01活菌数较高，又保证有较高芽
2.2正交试验优化发酵培养条件由表2可知，各因素对菌株ZDXC-01活菌数影响的主
次顺序为接种量（因素A）＞起始pH值（因素C）＞转速（因素B）,最佳组合为A2B2C3,即接种量5%、转速200 r/min.起始砲数量的角度出发,最终确定菌株ZDXC-01发酵条件的优
化方案为A2B2C3o2.3生长曲线嗜气芽砲杆菌ZDXC-01在接种量5%、温度37弋、转速
200 r/min、起始pH值7.5及装液量25 mL/250 mL的最佳发
表2发酵培养条件优化正交试验统计结果W序号12 34 5 6 7
酵条件下的生长曲线如图2所示。从培养过程可知，芽砲的
—活菌数 芽砲数 芽砲率—
C xl09cfu,mL_l x 109 cfu • mL-1 %5
5 0 570 6.57..06..57..566 87173 0 42 95 536.7.7.7.A/%B形成伴随着菌株生长的整个过程,随着活菌数量的快速增加, 芽葩数也大量形成。培养到30-36h时,活菌数量达到了最大
5 5 5 7777304933145857140
1002000210220102201802200100201019930607 76 61 51
父
3..33.4.56 .233.2..8.5o
0.7 L4 z4 2.8.24.L.592.2 02 2
38 .963.7 .372 .0809.3625.376.80o 733.值 5.8xl09 cfu/mL,芽葩数达到 5.5xl09 cfu/mL。培养 42 h后,6.015.4.戶3.C£4 6。
0L1縣牺处
6.0o LEo5.n4 ・J
Oo6 0x3.、2.Lo縣 滦轶o
o o o o o
-2<006
012 18 24 30 36 42 48 54 60 66时间/h注:K代表活菌数均值;7?表示活菌数极差;K，代表芽砲数均值;表 示芽砲数极差。pH值7.5；各因素对菌株ZDXC-01芽砲数影响的主次顺序
图2 嗜气芽砲杆菌ZDXC-01生长曲线活菌数和芽砲数量下降。因此，最佳发酵培养时间控制在30-36 h较为合理，此时活菌数和芽砲数都达到了最大值。为起始pH值（因素C）＞接种量（因素A）＞转速（因素B）,最
92范建龙等:嗜气芽砲杆菌ZDXC-01产芽砲培养条件的优化3结论与讨论目前，微生物农药大多是以活菌制剂为主，随着保存时
发酵的初步研究，旨在为其工业发酵提供参考。若进行工业 发酵，需要进一步通过发酵罐试验确定相应的发酵参数。实 际应用过程中，菌株活菌数和芽砲的形成受多种因素影响，
需要不断通过试验进行优化。间的延长，活菌数量不断减少，从而影响微生物制剂的使用
效果。芽砲杆菌能够产生具有抵抗高温、干燥、辐射、酸、碱 等不良环境的芽砲，延长微生物菌剂的保存期网。嗜气芽砲
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用量节省成本，而且还能更充分地发挥作用。菌体生长和芽砲的形成受营养物质和环境等因素的综
合影响，本文主要考察了发酵培养时间、接种量、温度、转 速、起始pH值及装液量对嗜气芽砲杆菌形成芽砲的影响。
在pH值6.0-8.5的考察范围内，发现pH值在7.5时最适宜; 接种量的提高有利于活菌数量和芽砲数的增加，但过高反而
会导致菌量下降，经过正交试验发现接种量以5%为宜；嗜 气芽砲杆菌是好氧菌，装液量过多，通气量随之减少，活菌
数和芽砲数均呈下降趋势，减少装液量有利于增加活菌数和
芽砲数量，并且可以缩短发酵培养时间。因此，嗜气芽砲杆 菌ZDXC-01在摇瓶中的最适发酵条件：发酵时间30-36 h,
接种量5%、温度37咒、转速200 r/min、起始pH值7.5、装液 量25 mU250 mL。优化后发酵菌液含菌量为5.8xl09cfu/mL, 与初始发酵工艺的发酵菌液含菌量(2.2X109 cfu/mL)相比，
提高了 163.6%；优化后发酵菌液芽砲数为5.5X109cfu/mL,与 初始发酵工艺的发酵菌液芽砲数(1.8x109 cfu/mL)相比，提
高了 205.6%。本试验对嗜气芽砲杆菌ZDXC-01菌株只进行了摇瓶 (上接第页)3结论与讨论试验结果表明,75%肪菌•戊哩醇水分散粒剂300 g/hn?、
12.5%氟环哩悬乳剂600 mI7hm\\32.5%苯甲•嗨菌酯悬乳剂
表2添加肥料与植物生长调节剂对水稻稻曲病
的防治效果处理B(b2b3ck2病穗率1.231.150.926.96防效82.33 aA83.48 aA86.78 aA600 mL/hm2J%申嗪霉素悬乳剂750 mIThm2对稻曲病的防
效均高于80%,在生产上均可使用，但须在水稻破口前10~ 12 d施用，并添加磷酸二氢钾3 000 g/hn?和芸苔素90 g/hn?。
4参考文献[1] 诸根•不同杀菌剂预防山粳杂交稻稻曲病田间药效试验*科技,2018(6):93.表3不同用药时期对稻曲病防治效果的影响[J].现代农业
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肪菌•戊吐醇水分散粒剂对稻曲病的防治效果最好,齐穗期 用药在生产上没有防治意义。(上接第90页)因此，在生产上可以使用甲氟•三哩磷2 000倍液、阿维・
丙漠磷1 500倍液、40%丙漠磷1 000倍液防治柑橘红蜘蛛。
防治时机为害螞每叶2头以下时，全年防治时注意轮换使
用多种不同杀媾机理的杀嗾剂，以免柑橘红蜘蛛对药剂产
生抗性。4参考文献[1]张勇军，王小平，吴全明•柑橘红蜘蛛防治存在的问题及对策建议[J].
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