维普资讯 http://www.cqvip.com ２００７年８月 农垦医学 Ａｕｇ．２００７ Ｖ０１．２９ Ｎｏ．４ 第２９卷第４期 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｎｇｋｅｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ・论著・ ＰＣＲ方法鉴定结核分枝杆菌临床分离株 黄 春 李 蕾２ 吴 芳２ 王 萍２ 吴江东２ 杜 燕２ 张万江２ （１．石河子大学２００４级病理学与病理生理学研究生； ２．石河子大学医学院地方与民族高发病重点实验室，石河子，８３２００２） 【摘要】目的：用３对引物ＰＣＲ扩增的方法对结核分枝杆菌临床分离株进行菌种鉴定。方法：将３对特征性的 结核分枝杆菌标记基因：ＭＦｒ４０基因、ａ抗原基因和ＩＳ６１００插入序列，分别放入ＰＣＲ体系中，在各自的退火温度下进 行ＰＣＲ扩增，通过对扩增产物的不同带型进行分析，对结核分枝杆菌临床分离株进行菌种鉴定。结果：用３对引物 ＰＣＲ扩增的方法可将各种类型的结核分枝杆菌以及结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌鉴别开。结论：３对引物ＰＣＲ 扩增的方法是一种有效的结核分枝杆菌菌种鉴定的方法，可用于结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌以及各种类型的 结核分枝杆菌的区分。 【关键词】结核分枝杆菌；菌种鉴定；聚合酶链反应 中图分类号：Ｑ７８ｌ 文献标识码：Ａ 结核病是由结核分枝杆菌引起的世界性传染 病，也是单一致病菌感染导致死亡率最高的感染性 疾病。近年来随着人口流动增加、ＨＩＶ与结核分枝 杆菌伴发感染以及结核分枝杆菌多重耐药性菌株的 倍，１．５１倍和３．８８倍。结核病死亡率为３８．１０／１０ 万，肺结核死亡率为３４．６４／１０万，结核病疫情南疆 高于北疆，农村高于城市，少数民族高于汉族 ２ Ｊ。 面对结核病流行的复杂性以及区域之间的显著 差异性，对采集的分枝杆菌标本进行菌种鉴定是必 要的。也是科学研究、明确诊断以及合理用药的基 础。目前，结核分枝杆菌菌种鉴定多采用ＰＣＲ技术 出现等原因，使全球结核病疫情再度回升，全球每年 新发结核病患者１ ０００万人，死亡３００万人，因此，世 界卫生组织（ＷＨＯ）将结核病与艾滋病、疟疾列为二 十一世纪人类需要攻克的三大传染性疾病之一。 取代复杂、费时的传统生化实验方法，但是，在应用 ＰＣＲ技术作为诊断工具多年以后，人们逐渐发现了 它的一些缺陷。例如，结核分枝杆菌常用的基因诊 我国是全球２２个结核病高负担国家之一，疫情 较为严峻，流行趋势呈现出患病年轻化、病变多系统 化的特点。全国已有５．５亿人受到感染，发病率、死 亡率和耐药率均明显高于发达国家水平，特别是广 大农村由于经济发展慢、卫生条件较差，流行蔓延趋 势尤为严峻。根据２０００年进行的第４次全国结核 断工具是ＩＳ６１００插入序列，但在某些结核分枝杆菌 菌株的基因组ＤＮＡ中缺乏此序列，则会出现假阴性 结果。同时它也不能将感染人型的结核分枝杆菌从 其它类型的结核分枝杆菌中区别开，这使得ＰＣＲ技 术的应用受到。 文献报告的多重ＰＣＲ技术【３ Ｊ，将３对特征性的 结核分枝杆菌标记基因：ＭＰＴ４０基因、ａ抗原基因和 ＩＳ６１００插入序列在同一个体系中进行扩增，即用３ 对结核分枝杆菌特异性引物，在同一退火温度条件 下同时扩增待检菌株的基因组ＤＮＡ，可以一次性将 病流行病学抽样调查结果估算，目前我国约有４５０ 万活动性肺结核病人，结核病人数位居世界第２位， 约占全球结核病人的四分之一，传染性肺结核病人 约１５０万，每年约有１２．７万人死于结核病…。 维吾尔自治区第４次结核病流行病学抽样 调查报告结果显示：全区活动性肺结核患病率为 ４６３．６５／１０万。菌阳患病率为２５２．２３／１０万，涂阳患 病率为１５９．５０／１０万，分别是全国平均水平的１．２６ 分枝杆菌与非分枝杆菌、结核分枝杆菌与非结核分 枝杆菌鉴别开。更重要的是，可以将感染人型的结 基金项目：国家自然科学基金３０４６０１２９ ＊：通讯作者张万江，病理生理学副教授，硕士生导师，Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｗｊｌ】１７＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ・２４５・ 维普资讯 http://www.cqvip.com 第４期 农垦医学 第２９卷 核分枝杆菌与牛型结核分枝杆菌、鸟型结核分枝杆 菌等较易混淆的菌种鉴别开，而且，当菌株缺乏 ＩＳ６１００插入序列时仍可以靠另外的种特异标记基因 Ｍｌ￣４０将结核分枝杆菌鉴定出来。 本实验验证了上述方法。虽然可以达到将结核 ＣＡＧＣｑ＇Ｇ＇Ｗ＿．Ｃ３ ）扩增表达３２ｋＤａ蛋白的基因序列＿４ ； ｔｆｌ（５ ＣＧＧＣＡＡＣＧＣＧＣＣＧＴＣＧＧＴＧＧ ３ ）和ＦＩ＇２（５ ＣＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＧＧＧ３ ）扩增表达ＭＴＰ４０种 特异蛋白的基因序列Ｉ５ ；ＩＳ５（５ ＣＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＣＣ ＧＴＡ ＡＣＴＧＧ３ ）和ＩＳ６（５ ＣＡＴＧＧＡＣＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣ兀 Ｇ 分枝杆菌与非结核分枝杆菌以及不同类型的结核分 枝杆菌鉴别开的目的，但是，将３对分枝杆菌标记基 因在同一个反应体系进行扩增比较困难，先分析原 Ｃ ３ ）扩增ＩＳ６１１０插入序列 。扩增的总反应体积 为５０ｖＬ，其中ＤＮＡ模板１～２ｔ，－Ｌ，引物各０．４ｔａｎｏｌ（上 海生工生物工程技术服务有限公司合成，ＰＡＧＥ纯 因如下。 １材料与方法 １．１材料 １．１．１ 标准株 结核分枝杆菌国际标准强毒株 Ｈ３７Ｒｖ株和国际标准弱毒株Ｈ３７Ｒａ株由中国药品 生物制品鉴定所提供。 １．１．２临床分离株 ｌ２株临床分离株分枝杆菌均 来自阿勒泰地区疾病控制中心。 １．１．３培养基改良罗氏固体培养基用于分枝杆 菌的活化、传代培养。苏通液体培养基用于分枝杆 菌的培养。 １．１．４主要试剂ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ，ｄＮＴＰ ｍｉｘ，Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｍｓｅ为日本ＴａＫａＲａ公司产品，ＰＣＲ弓ｌ物、 １００ｂｐＤＮＡ梯度Ｍａｒｋ由上海生工生物工程技术服务 有限公司提供，Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ为美国ＢＢＩ公司产品，三 氯甲烷为天津大茂化学试剂厂产品，苯酚、异丙醇、 无水乙醇为上海试剂一厂产品，溴酚兰、ＥＢ为美国 Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品，１×ＴＡＥ按照《分子克隆》方法配 制。 １．２方法 １．２．１菌株的培养１２例临床菌株标本均取自痰 菌涂片阳性及胸片证实为活动性肺结核病患者，经 １％的碳酸氢钠处理后，罗氏固体琼脂培养基分离培 养得到阳性菌落。结核分枝杆菌国际标准强毒株 Ｈ３７Ｒｖ菌株、国际标准弱毒株Ｈ３７Ｒａ菌株和临床分 离株均接种于苏通液体培养基，３７￣Ｃ静置培养４周， 形成片状淡黄色新鲜菌落。 １．２．２基因组ＤＮＡ的提取收集浮于液体表面的 新鲜菌落；稍加研磨后重悬于一定体积的溶菌酶和 蛋白酶Ｋ溶液中，３７￣Ｃ水浴５小时，采用标准酚一氯 仿纯化法提取结核分枝杆菌国际标准强毒株Ｈ３７Ｒｖ 菌株、结核分枝杆菌国际标准弱毒株Ｈ３７Ｒａ菌株和 临床分离株基因组ＤＮＡ（具体方法从略）。 １．２．３ ＰＣＲ扩增设计引物分别为：ＭＴ１（５ ＴｒＣＣＴ ＡＣＣＡＣＣＣＡＣＣ１ ＣＣＧ３ ）和ＭＴ２（５ ＣＣＣＣＡＧＴＡＣＴ ＣＣ ・２４６・ 化），ＴａｑＤＮＡ聚合酶２．５ｔｔＬ／反应，ｄＮＴＰ ２００ｔｔｍｏｌ，１× ＰＣＲ缓冲液。扩增用美国ＥＲＩＣＯＭＰ公司ＰＣＲ仪。 热循环为：９４ｏＣ×ｌｍｉｎ、７１ ｏＣ×１．５ｍｉｎ、７２ｏＣ×２ｍｉｎ， 反复３５次后，再以７２￣Ｃ保持１０ｍｉｎ，热循环结束。 分次ＰＣＲ热循环条件：扩增表达３２ｋＤａ蛋白的 基因序列的热循环条件为：９４ｃＣ×ｌｍｉｎ、６６ｃＣ×１．５ ｉｍｎ、６８ｏＣ×２ ｍｉｎ，反复３５次后再以６８ｃｃ保持ｌ０ ｉｍｎ，热循环结束。扩增表达ＭＴＰ４０种特异蛋白的 基因序列的热循环条件为：９４ｏＣ×１ ｍｉｎ、６７ｃｃ×１．５ ａｒｉｎ、７１ ｏＣ×２ ｍｉｎ，反复３５次后再以７ｌ ｃｃ保持ｌ０ ｍｉｎ，热循环结束。扩增ＩＳ６１１０插入序列的热循环条 件为：９４ｏＣ×１ ｍｉｎ、７０ｏＣ×１．５ ｍｉｎ、７２ｏＣ×２ ｍｉｎ，反 复３５次后再以７２￣Ｃ保持１０ ｉｍｎ，热循环结束。 １．２．４扩增产物的分析以１．５％含染色剂（５０ｔ￣ｇ／ ｌＯＯｍｌ溴化乙锭）琼脂糖凝胶进行恒压电泳，扩增产 物５ 孔，上样缓冲液为溴酚蓝和二甲青胺的混合 液。电泳缓冲液为Ｉ×ＴＡＥ缓冲液。 ２结果 ２．Ｉ ＰＣＲ对分枝杆菌鉴定的特异性ＰＣＲ扩增分 枝杆菌ＤＮＡ时产生１～３条带。其中引物Ｐｒ１、ＦＩ＇２ 引导扩增的是一段约４００ｂｐ长的种特异带；引物 ＭＴ１、Ｍ１２引导扩增产生１条５００ｂｐ的属特异带；而 引物ＩＳ５、ＩＳ６引导扩增产生１条１０００ｂｐ的结核分枝 杆菌复合群特异带。感染人型结核分枝杆菌基因组 ＤＮＡ扩增产物为３条带，牛型结核分支杆菌为２条 带（ＭＴ和ＩＳ），非结核分枝杆菌只有１条带（ＭＴ），而 非分枝杆菌则不产生带的扩增见表１。 表１各种菌株ＰＣＲ扩增结果 ２．２经用ＰＣＲ技术对结核分枝杆菌国际标准强毒 维普资讯 http://www.cqvip.com
２００７年８月 农垦医学 Ａｕｇ．２００７ Ｖ０１．２９ Ｎｏ．４ 第２９卷第４期 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｎｇｋｅｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 株Ｈ３７Ｒｖ株和国际标准弱毒株Ｈ３７Ｒａ株进行菌种 鉴定，结果均为３条带，证明了该方法的可重复性 （图１）。对１２株地区结核分枝杆菌临床分离 株进行菌种鉴定，发现其中有１株为牛型结核分枝 标记基因，对采集的地区结核分枝杆菌临床分 离株进行菌种鉴定，同时对中国药品生物制品鉴定 所提供的已知菌种结核分枝杆菌国际标准强毒株 Ｈ３７Ｒｖ株和国际标准弱毒株Ｈ３７Ｒａ株进行验证，结 杆菌，其它均为感染人型结核分枝杆菌复合群。用 ３对引物联合扩增地区结核分枝杆菌临床分离 果表明：该方法确实可以达到将结核分枝杆菌与非 结核分枝杆菌以及不同类型的结核分枝杆菌鉴别开 的目的，而且对已知菌种结核分枝杆菌国际标准强 株，虽可获得三条不同的ＤＮＡ带谱，但重复性差， 重复２０次，可成功１次，成功率５％；而用代表种、 属和群的３对单引物分次扩增地区结核分支杆 菌临床分离株，也可获得同样的结果，而且重复性 好，重复２０次，可成功１０次，成功率５０％（图２）。 Ｍ １ ２ ３ 司 ５ ６ １、３、５：代表种、属和群的单引物扩增结核分枝杆菌国 际标准强毒株Ｈ３７Ｒｖ株ＤＮＡ带谱；２、４、６：代表种、属 和群的单引物扩增结核分枝杆菌国际标准弱毒株 Ｈ３７Ｒａ菌株ＤＮＡ带谱；Ｍ：￣００ｂｒｌＤＮＡ梯度Ｍａｒｋ。 图１ 分次ＰＣＲ扩增结核分枝杆菌国际标准株结果 Ｍ ｌ ２ ３ ４ ５ １ ０００ｂＤ一 ５００ｂＤ—— ４００ｂｐ—— １：３对引物联合扩增大肠杆菌对照组；２：３对引物联 合扩增结核分枝杆菌临床分离株ＤＮＡ带谱；３、４、５： 代表种、属和群的单引物扩增地区结核分枝杆 菌临床分离株ＤＮＡ带谱；Ｍ：１００ｂｐＤＮＡ梯度Ｍａｒｋ。 图２结核分枝杆菌临床分离株ＰＣＲ扩增结果 ３讨论 ３０９医院的王仲元等报告的多重ＰＣＲ技 术，将３对特征性的结核分枝杆菌标记基因在同一 个体系中进行扩增，可以一次性将分枝杆菌与非分 枝杆菌、结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌鉴别开。 本室采用该方法，用这３对特征性的结核分枝杆菌 毒株Ｈ３７Ｒｖ株和国际标准弱毒株Ｈ３７Ｒａ株进行的 验证性试验具有可重复性，但是，在ＰＣＲ扩增时发 现：将３对引物置于同一个反应体系进行扩增比较 困难，成功率较低，只有５％，故加以变动，将３对引 物置于不同退火温度条件下，分别扩增待检菌株的 基因组ＤＮＡ，成功率提高，达到５０％，较容易地得到 了菌种鉴定结果。 总结原因可能是：①变性所需Ｔｍ值不同：在第 一轮循环前，使模板完全解链需要的温度和时间是 由基因组的Ｔｍ值决定的，而Ｔｍ值的高低又是由 ＧＣ含量决定的，当用３对引物同时进行ＰＣＲ扩增 时，由于各自的ＧＣ含量不同，各自的Ｔｍ值不同，很 难在同一个退火温度下完成扩增。例如，４００ｂｐ引 物中ＭＴ１的ＧＣ含量是８０％，Ｔｍ值是７０．１０，ＭＴ２的 ＧＣ含量为９０％，Ｔｍ值是７４．２０；５００ｂｐ引物中Ｐｒｒ１ 的ＧＣ含量是７０％，Ｔｍ值是６６．０，Ｐ－１２的ＧＣ含量是 ６６．６７％，Ｔｍ值是６５．８２；１０００ｂｐ引物中Ｉｓ５的ＧＣ含 量是６５％，Ｔｍ值６３．９５，ＩＳ６的ＧＣ含量是７０％，Ｔｍ 值是６６．ｏｏ（上海生工生物工程技术服务有限公司 提供）。所以，３对引物同时进行ＰＣＲ扩增时会导致 富含ＧＣ的１Ｉｍ值高的序列变性不完全，ＤＮＡ双链会 很快复性，导致ＤＮＡ产量减少甚至使ＰＣＲ失败，提 高变性温度或变性时间过长又会导致酶活性的损 失，很难兼顾。②退火温度有差异：退火温度是ＰＣＲ 的一个关键参数。合理的退火温度从５５￣Ｃ到７０￣Ｃ， 以保证引物同目的序列有效结合，退火温度越高，所 得产物的特异性会越高，会减少引物二聚体和非特 异性产物的形成。一般情况下，如果两个引物Ｔｍ 值不同，将退火温度设定为比最低的Ｔｍ值低５℃即 可。但如果６个引物Ｔｍ值均不同，则很难将退火 温度设定在一个都可以兼顾的温度。③延伸所需时 间不同：延伸反应通常为７２￣Ｃ，接近于Ｔａｑ ＤＮＡ聚 合酶的最适反应温度７５℃。延伸反应时间的长短 取决于目的序列的长度和浓度，在一般反应体系中， Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶每分钟约可合成ｌｋｂ长的ＤＮＡ。延 伸时间过长会导致产物非特异性增加。将３条ＤＮＡ 片段长度不同的序列在同一体系中同时延伸，需要 ・２４７・ 维普资讯 http://www.cqvip.com
第４期 农垦医学 第２９卷 的时间不同，势必导致短片段延伸时间过长或长片 乏ＩＳ６１ １０插入序列的结核分枝杆菌的诊断是一个 段延伸时间过短的现象发生，导致试验结果不稳定。 很大的补充。另外，本文鉴定的菌株尚少，有待进一 ④循环次数不同：当其它参数确定之后，循环次数 步积累经验。 主要取决于ＤＮＡ浓度。循环次数过多，会使ＰＣＲ 产物中非特异性产物大量增加。如果小片段序列与 参考文献 大片段序列同时扩增，一方面，小片段序列在反应中 ｌ 全国结核病流行病学抽样调查技术指导组．第四次全国结核病流 消耗的Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶量与大片段序列不同；另一 行病学抽样调查报告［Ｊ］．中华结核和呼吸杂志，２００２ 方面，在扩增后期，由于产物积累，使原来呈指数扩 ２金鑫，范新春，闰化奎，等．维吾尔自治区第四次结核病流 行病学抽样调查报告［Ｊ］．中国防痨杂志，２００４ 增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明 ３王仲元，匡铁吉，金关甫，等．复方ＰＣＲ用于分支杆菌菌种鉴定的 显上升，出现平台期，小片段序列就会出现由于错配 初步研究．中国防痨杂志，２００３，２５（６）：３９１ 而产生的低浓度非特异性产物大量扩增，达到较高 ４ Ｂｏｒｒｅｍａｎｓ Ｍ Ｌ，Ｗｉｔｔｅｒ Ｄ，Ｖｏｌｃｋａｅｒｔ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｃｌｏｎｉｎｇ，．￣￣］ｌｌｅｎｃｅ ｔｅｎｎｉｎａｔ－ 水平。 ｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｏ ｏｆ ａ ３２ ｋｉｌｏ Ｄａｌｔｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 因此，本实验认为，将３对结核分枝杆菌标记基 ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｎｌｍｕｎ，１９８９，５７：３１２３～３ｌ３Ｏ ５ Ｐａｒａ Ｃ Ａ，Ｌｏｎｄｏｎｏ Ｌ Ｐ，Ｐｏｒｅｉ１１ｏ Ｐ Ｄ，ｅｔ ａ１．１ｓｏｌ￣ｉｎｏ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｎｏ ａｎｄ 因在同一个反应体系进行扩增比较困难，成功率低， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｓｐｅｃｉｉｆｃ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｔｉｇｅｎ： 只有５％，不适合临床应用。改为分次ＰＣＲ扩增，成 ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｅ，１９９１，５９： 功率提高，达５０％，可以达到同样目的。总之，应用 ３４ｌ１～ｌ７ ＰＣＲ技术可以有效地鉴别结核分枝杆菌和非结核分 ６ Ｔｈｉｅｒｒｙ Ｄ Ａ．Ｂｒｉｓｓｏｎ Ｎｏｅｌ Ｖ．Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌ Ｆ，ｅｔ ａ１．ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ 枝杆菌以及不同类型的结核分枝杆菌，弥补了以往 Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｓｏｉｓ ｉｎｓｅｒｔｉｎｏ ｓｅｑｕｅＥｌｅｅ ＩＳ ６１ １０，ａｎｄ ｉｔｓ 单基因ＰＣＲ技术用于结核病诊断的不足，尤其对缺 ａｐｐｌｉｃａｔｉｎｏ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｊ ＣｌｉｎＭｉｃｎ￣ｏｌ，１９９０．２８：２６６８～７３ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉ ｐｒｉｍｅｒ ＰＣＲ Ｈｕａｎｇ Ｃｈｕｎ ，Ｌｉ ｌｅｉ２，Ｗｕ Ｆａｎｇ，Ｗａｎｇ ｐｉｎｇ￣，Ｗｕ Ｊｉａｎｇｄｏｎｆ，Ｄｕ ｙｎａ２，Ｚｈｎａｇ Ｗａｎｊｉｎａｇ３ （１，Ｔｈｅ ｍａｓｔｅｒ ｏｆ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｇｒａｄｅ ２００４ Ｓｈｉｈｅｚｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ； ２．Ｔｈｅ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｓｈｉｈｅｚｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙｔ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ； ３．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｘｉｎｊｉｎａｇ ｅｎｄｅｍｉｃ ａｎｄ ｅｔｈｎｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｉｎ Ｓｈｉｈｅｚｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙｔ，Ｓｈｉｈｅｚｉ，８３２００２） 【Ａｂａｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｄｏ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃｌｌｉｎｉｃａｌ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｗｕｌｏｓｉｓ ｗｉｔｈ ｍｕｈｉｐｒｉｍｅｒ ＲＣＲ． Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｕｓｅ ｔｈｔ￣ｔ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｓｏｌｎｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓ［￣ｉｎｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ： ｓ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｗｕｌｏｓｉｓ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｒｏｍ Ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ ｏｒ ｄｏｓｅ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｆｒｏｍ Ｍ．ｂｏｖｉｓ．Ｃｏｎｄｕｓｉｏｎ：Ｉｔ ｓｈｏｗｄｅ ｔｈａｔ ｍｕｈｉｐｒｉｍｅｒ ＰＣＲ ｉｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｄｅｎｔｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆｒ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｆｉａ．Ｓｏ ｉｔ ｃａｌｌ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｌ‘ｉｉｎｔｉｌａ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ Ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ Ｍｙｃｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ ｏｒ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｎｏｎ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ． 【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｍｙｃｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ；Ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ；ＰＣＲ ・２４８・