(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 111978323 A(43)申请公布日 2020.11.24
(21)申请号 201910426246.8(22)申请日 2019.05.21
(71)申请人 郑州大学
地址 450001 河南省郑州市高新区科学大
道100号(72)发明人 刘兴江 周爽 肜一凡 魏柳荷
孙爱灵 (51)Int.Cl.
C07D 471/06(2006.01)C09K 11/06(2006.01)G01N 21/(2006.01)
权利要求书1页 说明书5页 附图4页
(54)发明名称
一种识别谷胱甘肽的荧光探针(57)摘要
本发明公开了一种基于萘酰亚胺-吲哚生色团的特异性识别谷胱甘肽的荧光探针及其制备
方法，其结构如下：
CN 111978323 A该探针选择性好，抗干扰能力强，同时在检测过程中具有较长波长发射和较大斯托克斯位移，可以减少背景干扰以及提高检测灵敏度。该探针可用于样品内谷胱甘肽的检测，并能区分谷胱甘肽与半胱氨酸/同型半胱氨酸。
权 利 要 求 书
一种识别谷胱甘肽的荧光探针，其结构式为：
2
1/1页
CN 111978323 A
1.CN 111978323 A
说 明 书
一种识别谷胱甘肽的荧光探针
1/5页
技术领域
[0001]本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种新型的谷胱甘肽荧光探针的制备方法，以及该探针在检测谷胱甘肽方面的应用。背景技术
[0002]谷胱甘肽(GSH)在哺乳动物，尤其是人类的生物系统中含量非常丰富，其在维持氧化还原稳态、防御自由基和毒素方面起着至关重要的作用，许多研究都集中在确定健康所需的，细胞和血浆中谷胱甘肽的浓度水平。生命系统中异常浓度的谷胱甘肽与各种疾病密切相关，如癌症、帕金森病、阿尔茨海默病、骨质疏松症和心血管疾病等。目前识别巯基类化合物的荧光探针大多数都基于巯基的亲核性，但是由于谷胱甘肽与半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)具有相似的结构，导致很多巯基类探针无法很好地区分三者中的某一种。因此，合成一种能特异性检测谷胱甘肽的探针，无疑将在哺乳动物生理学中发挥巨大作用。发明内容
[0003]为克服现有技术的不足，本发明目的之一是提供一种同时具有较长波长发射和较大斯托克斯位移，并能经过单通道区分谷胱甘肽与半胱氨酸/同型半胱氨酸的荧光探针；目的之二是提供其制备方法。
[0004]本发明中的荧光探针，其结构为：
[0005]
本发明中的荧光探针通过以下反应制备，合成过程如下：
3
CN 111978323 A
说 明 书
2/5页
具备方法如下：(a)将化合物1溶于乙二醇单甲醚中，升温至115℃直到反应液
变澄清，然后往上述混合液中缓慢滴加水合肼(80％)，滴加完毕后将混合液继续升温至125℃，回流反应3小时，待反应结束后，冷却至室温，析出大量橘黄色沉淀，抽滤洗涤，得到化合物2。(b)将化合物2溶于3-甲基-2-丁酮中，然后逐滴滴加浓硫酸，反应混合液在氮气保护下回流搅拌4小时，待反应结束后，减压旋转蒸去多余的3-甲基-2-丁酮，得到黑色粗产品，经硅胶柱层析分离纯化得到浅黄色固体产品3。(c)将化合物3和对羟基苯甲醛溶解于重蒸的甲苯中，搅拌均匀后依次加入冰醋酸和哌啶到上述混合液中，滴加完毕后，混合液在氮气保护下回流搅拌6小时，待反应结束后，减压旋转除去甲苯，得到粗产品，经柱层析分离纯化得到红色固体产品4。(d)将化合物5溶于甲苯中，然后加入3-羟基-N，N-二乙基苯胺，反应液在111℃回流搅拌7小时，反应完毕后，抽滤洗涤，得到浅黄色粉末6。(e)在氮气保护下，将新蒸的N，N-二甲基甲酰胺逐滴加至三氯氧磷中，在35℃搅拌30分钟后加入化合物6，升温至60℃搅拌12小时，待反应完成后，将反应液倒入冰水中，用20％的氢氧化钠溶液调节pH，得到大量沉淀，抽滤洗涤，得到橘黄色固体7。(f)在冰浴条件下，将化合物7和间苯二酚溶于乙腈中，搅拌5分钟，然后加入亚氯酸钠和磷酸二氢钠，继续搅拌30分钟，反应结束后，将反应液倒入冰水中，用1M的盐酸溶液调节pH，形成大量沉淀，抽滤洗涤，得到黄色固体8。(g)将二苯
4
[0006]
CN 111978323 A
说 明 书
3/5页
基二硒醚和硼氢化钠溶于乙醇中，在室温和氮气保护条件下，搅拌10分钟后得到无色溶液9，另取化合物8和三乙胺溶于重蒸的N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入化合物9，在室温下搅拌20分钟，反应结束后，将反应液倒入蒸馏水中，用二氯甲烷萃取，合并并洗涤有机层，干燥浓缩，得到橘黄色固体10。(h)将化合物10和化合物4溶于重蒸的二氯甲烷中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，在室温下搅拌12小时，反应完毕后，将反应液减压旋蒸除去部分溶剂，经柱层析分离纯化得到橘黄色固体产品11，即探针分子。
[0007]本发明的荧光探针其检测机制如下：
荧光探针本身无荧光，与谷胱甘肽反应后，苯硒基部分从探针上离去，发射出橙红色荧光。
本发明的荧光探针其最大吸收峰在444nm，与谷胱甘肽反应后最大发射峰在570nm，斯托克位移为126nm。
[0009]本发明的荧光探针在测试过程中选择的激发波长为488nm。[0010]本发明的荧光探针选择性好。探针的测试体系为pH为7.4的10mM的PBS缓冲溶液溶有1.0mM CTAB，25℃下测试。探针本身处于无荧光的状态，在加入150倍当量的谷胱甘肽之后，在最大发射波长570nm处的荧光强度增大了6.5倍。加入与谷胱甘肽结构相似的半胱氨酸、同型半胱氨酸后，荧光强度有较弱的增强。而在加入其检测物(Thr、Ser、Val、Pro、Met、Trp、Phe、Arg、His、Leu、Gly、Glu、Tyr、S2-、S2O32-、SO42-、SO32-、HSO3-、SCN-、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、H2O2)后，荧光强度没有发生明显变化。
[0011]本发明的荧光探针抗干扰能力强，在其他检测物(Thr、Ser、Val、Pro、Met、Trp、Phe、Arg、His、Leu、Gly、Glu、Tyr、Cys、Hcy、S2-、S2O32-、SO42-、SO32-、HSO3-、SCN-、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、H2O2)的存在下几乎不影响检测谷胱甘肽的效果。
[0012]本发明的荧光探针在加入150倍当量的谷胱甘肽作用后，荧光立即增强，在60min左右达到平衡。
[0013]本发明的荧光探针可以对谷胱甘肽进行定量检测。[0014]本发明的荧光探针线性较好，线性相关系数R＝0.9944。[0015]本发明的荧光探针pH应用范围较宽，从pH＝6.0到pH＝12.0均可检测。
[0016]本发明所述的探针分子对谷胱甘肽(GSH)响应后的发射波长在近红外区，斯托克斯位移大，具有良好的选择性和抗干扰能力，并且具有好的灵敏度和较宽的应用范围，该荧光探针在生理与化学等领域具有实际的应用价值。
5
[0008]
CN 111978323 A
说 明 书
4/5页
附图说明
[0017]图1为本发明的荧光探针(10.0μM)在pH为7.4的10mM PBS缓冲溶液(包含1.0mM CTAB)中，与浓度逐渐递增的谷胱甘肽(GSH)作用后的荧光光谱变化，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
[0018]图2为本发明的荧光探针(10.0μM)在pH为7.4的10mM PBS缓冲溶液(包含1.0mM CTAB)中，与谷胱甘肽(GSH)作用过程中570nm处荧光强度与浓度的线性关系，横坐标为浓度，纵坐标为荧光强度。
[0019]图3为本发明的荧光探针的选择性，荧光探针在pH为7.4的10mM PBS缓冲溶液(包含1.0mM CTAB)中，与GSH、Thr、Ser、Val、Pro、Met、Trp、Phe、Arg、His、Leu、Gly、Glu、Tyr、Cys、Hcy、S2-、S2O32-、SO42-、SO32-、HSO3-、SCN-、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、H2O2作用后的荧光光谱，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
[0020]图4为本发明的荧光探针的抗干扰性，在pH为7.4的10mM PBS缓冲溶液(包含1.0mM CTAB)中，荧光探针、谷胱甘肽(GSH)和其它分析物(Thr、Ser、Val、Pro、Met、Trp、Phe、Arg、His、Leu、Gly、Glu、Tyr、Cys、Hcy、S2-、S2O32-、SO42-、SO32-、HSO3-、SCN-、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、H2O2)共存时与不含其它分析物时，分别作用后的荧光强度比值(IProbe+others+GSH/IProbe+GSH)柱状图。
[0021]图5为本发明的荧光探针(10.0μM)在pH为7.4的10mM PBS缓冲溶液(包含1.0mM CTAB)中，与谷胱甘肽(GSH)作用过程中570nm处荧光强度随时间的变化，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。
[0022]图6为本发明的荧光探针(10.0μM)在不同pH值的缓冲溶液中，与谷胱甘肽(GSH)作用前后在570nm处的荧光强度变化，横坐标为pH值，纵坐标为荧光强度。[0023]图7为本发明的荧光探针(10.0μM)在pH为7.4的10mM PBS缓冲溶液(包含1.0mM CTAB)中，与谷胱甘肽(GSH)作用前后的紫外吸收光谱变化。
具体实施实例[0024]实施例1：化合物2的合成
取化合物1(3.32g，10.0mmol)溶解于60mL乙二醇甲醚中，逐渐升温至115℃直到反应液变澄清，然后往上述反应液中逐滴滴加3.5mL水合肼(80％)，滴加完毕后将反应混合液继续加热，在125℃回流搅拌3小时，待反应完成后，冷却至室温，析出大量的深黄色沉淀，抽滤洗涤，真空干燥，得到橘黄色块状产品2。产量：2.32g；产率：81.9％。[0025]实施例2：化合物3的合成
取化合物2(1.42g，5.0mmol)溶解于60mL的3-甲基-2-丁酮中，然后逐滴加入2.5mL浓硫酸，滴加完毕后，反应混合液在氮气保护下升温至95℃，反应4小时，待反应结束后，减压旋转蒸去多余的3-甲基-2-丁酮，得到黑色粗产品，然后经柱层析分离纯化(石油醚/二氯甲烷＝1/10，v/v)真空干燥，得到浅黄色固体产品3。产量：0.81g；产率：48.5％。[0026]实施例3：化合物4的合成
取化合物3(0.50g，1.5mmol)和对羟基苯甲醛(0.18g，1.5mmo)溶解于15mL重蒸的甲苯中，接着依次滴加0.02mL冰醋酸和0.05mL哌啶，滴加完毕后，反应混合液在氮气保护下加热回流6小时，待反应结束后，减压旋转除去甲苯，得到粗产品，然后经柱层析分离纯化(乙醇/二氯甲烷＝1/50，v/v)，真空干燥，得到红色固体产品4。产量：0.34g；产率：51.7％。
6
CN 111978323 A[0027]
说 明 书
5/5页
实施例4：化合物6的合成取化合物5(0.g，2.5mmol)溶解于12mL甲苯中，然后加入3-羟基-N，N-二乙基苯胺(0.41g，2.5mmol)，在111℃回流搅拌7小时。反应完毕后，抽滤反应混合液得到滤饼，用甲苯洗涤2次，真空干燥，得到浅黄色粉末产品6。产量：0.45g；产率：72.5％。[0028]实施例5：化合物7的合成
在氮气氛围下，将0.8mL新蒸的N，N-二甲基甲酰胺逐滴加入0.8mL三氯氧磷中，在35℃搅拌30分钟，生成一个浅粉色溶液。然后另取化合物6(0.42g，1.7mmol)溶解于2.5mL的N，N-二甲基甲酰胺中，将此溶液逐滴加入至上述反应液中，得到鲜红色混浊液，继续加热，在60℃搅拌12小时。待反应完成后，将反应液倒入25mL冰水中，用20％的氢氧化钠溶液调节pH，得到大量的沉淀，抽滤水洗，真空干燥，得到橘黄色固体产品7。产量：0.42g；产率：88％。[0029]实施例6：化合物8的合成
取化合物7(0.39g，1.4mmol)和间苯二酚(3.08g，28mmol)溶解于8.0mL乙腈中，在冰浴下搅拌5分钟，然后加入亚氯酸钠(0.43g，4.8mmol)和溶于2.0mL蒸馏水的磷酸二氢钠(0.76g，6.3mmol)，继续在冰浴下搅拌30分钟。反应结束后，将反应液倒入30mL冰水中，用1.0M的盐酸溶液调节pH，形成大量沉淀，抽滤用冰水洗，真空干燥，得到黄色固体产品8。产量：0.31g；产率：74.6％。[0030]实施例7：化合物10的合成
取二苯基二硒醚(0.31g，1.0mmol)和硼氢化钠(0.05g，1.3mmol)溶解于4.0mL乙醇中，在室温和氮气保护条件下搅拌10分钟，得到无色溶液为化合物9。另取化合物8(0.27g，0.9mmol)和三乙胺(360μL，2.7mmol)溶解于15mL重蒸的N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入化合物9(0.31g，2.0mmol)，在室温下搅拌20分钟。反应结束后，将反应液倒入80mL蒸馏水中，用二氯甲烷(40mL×3)萃取，合并有机层，用盐水和蒸馏水依次洗涤，再用无水硫酸钠干燥后减压旋蒸，真空干燥，得到橘黄色固体产品10。产量：0.35g；产率：92.0％。[0031]实施例8：探针的合成
取化合物10(0.21g，0.5mmol)和化合物4(0.22g，0.5mmol)溶于12mL重蒸的二氯甲烷中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.11g，0.55mmol)和4-二甲氨基吡啶(0.07g，0.55mmol)，在室温下搅拌12小时。反应完毕后，将反应液减压旋蒸除去部分溶剂，然后经柱层析分离纯化(乙酸乙酯/二氯甲烷＝1/20，v/v)，真空干燥，得到橘黄色固体产品11即探针分子。产量：0.18g；产率：42.4％。
7
CN 111978323 A
说 明 书 附 图
1/4页
图1
图2
8
CN 111978323 A
说 明 书 附 图
2/4页
图3
图4
9
CN 111978323 A
说 明 书 附 图
3/4页
图5
图6
10
CN 111978323 A
说 明 书 附 图
4/4页
图7
11